This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

1. Préparation des réactifs <ol><li> Préparer du tampon de regroupement (20 mM de Tris, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Stocker à température ambiante, stable pendant des mois. Supplément 1 mM de dithiothréitol (DTT) avant utilisation. REMARQUE: un tampon à base d&#39;HEPES (10 mM HEPES, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, DTT 5 mM) produit également des résultats similaires dans l&#39;agrégation de tau. </li><li> Préparer thioflavine T ou thioflavine solution stock S (3 mM, dissous dans un tampon d&#39;agrégation), et un filtre de 0,22 um unité de filtration stérile. Conserver à -20 ° C dans un tube couvert par une feuille d&#39;aluminium, stable pendant des mois. </li><li> Préparer la solution héparine de stock (300 um, dissous dans un tampon d&#39;agrégation). Conserver à -20 ° C, stable pendant des mois. </li><li> Préparer dithiothréitol (DTT) stock (1 M, dissous dans l&#39;eau). Aliquote dans 1,5 ml tubes. Stocker à -20 ° C. Avant essais d&#39;agrégation, décongeler la solution 1 M à température ambiante. De cette 1,000x mère, préparer une aliquote de 100 mM de travail avec de l&#39;eau déminéralisée. Laisser sur la glaceavant d&#39;être prêt. </li><li> Retirer tau de -80 ° C congélateur. Décongeler sur la glace. Ajuster tau à une concentration prédéterminée avec le tampon d&#39;agrégation. Centrifuger dans une microcentrifugeuse à 20 800 xg pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les gros agrégats préformés. Cette étape de pré-filage augmente la cohérence de la mesure de la fluorescence de chaque lot ultérieur de la préparation de protéine. Transférer le surnageant dans un autre tube; laisser sur la glace jusqu&#39;au moment d&#39;assembler la réaction d&#39;agrégation. </li></ol> 2. Non-dye, Assay Terminal REMARQUE: La réaction d&#39;agrégation de ce dosage est effectué en l&#39;absence du colorant fluorescent. Après avoir mélangé tous les composants, la réaction est laissée se dérouler à des points de temps prédéterminés. Aliquotes sont ensuite sortis de la réaction de l&#39;agrégation et mélangés avec ThT ou ThS pour la liaison avant lecture de fluorescence amyloïde. Le volume initial de la réaction d&#39;agrégation dépend du nombre de points de temps nécessaires. Cette approche peut REQUIRE une grande quantité de la protéine tau, mais est rapide, simple, et peut être fait dans un fluoromètre ou un lecteur de plaque multi-puits (voir Discussion). Ci-dessous est l&#39;opération étape par étape, avec l&#39;ISA SPEX FluoroMax-2 spectrofluorimètre compacte pour la fluorescence quantification. <ol><li> Mettre en place le mélange dans 1,5 ml agrégation des tubes Eppendorf comme dans le tableau 1. Chaque colonne représente les ingrédients nécessaires pour une réaction de 100 ul, ce qui est suffisant pour une mesure de temps de consigne. Ajustez la quantité pour l&#39;ensemble du mélange d&#39;agrégation sur la base des points de temps nécessaire à l&#39;expérience particulière. Ajouter supplémentaire de 10% de chaque composant pour donner de la place pour le pipetage erreur. Le mélange réactionnel contenant de l&#39;héparine typique représenté ici peut être remplacé par l&#39;acide arachidonique ou un tampon d&#39;agrégation. Ajouter du DTT à 1 mM dans le mélange réactionnel. Si la totalité de la réaction dure plus d&#39;une journée, compléter frais TNT quotidienne (1 mM) pour assurer un environnement réducteur. </li><li> Inverser le tube quelques fois pour mélanger. PlaCE chaque réaction dans un incubateur ou un bain d&#39;eau à 37 ° C. L&#39;agitation ne est pas nécessaire pour l&#39;agrégation de tau. </li><li> Avant de mesurer la fluorescence, allumer le spectrofluorimètre (lampe, puis ordinateur). REMARQUE: La lampe à arc au xénon qui peut être utilisé immédiatement. Cependant, pour de meilleurs résultats permettent à la machine de se réchauffer pendant environ 10 minutes avant de lire la fluorescence. </li><li> Démarrez le logiciel sur l&#39;ordinateur. <ol><li> Choisissez Temps réel mode Affichage en Instrument Control Center, définissez d&#39;onde d&#39;excitation à 450 nm (fente à 2 nm) et d&#39;onde d&#39;émission à 510 nm (fente à 5 nm). Fermer Temps réel fenêtre du mode d&#39;affichage pour revenir au Centre de contrôle Instrument. </li><li> Choisissez Analyse longueur d&#39;onde, appuyez sur Ajouter &gt;&gt; touche Constant dans le cadre supérieur d&#39;ajouter des longueurs d&#39;onde ensembles. Régler les paramètres d&#39;acquisition d&#39;erreur standard à 1 et essais maximum à 3, puis cliquez sur Ajouter. Cliquez sur Go! Pour ouvrir l&#39;affichage de donnéesfenêtre. </li><li> Dans la fenêtre d&#39;affichage de données, cliquez sur Démarrer Acq pour ouvrir la boîte de dialogue Nouvelle échantillon. Choisissez &quot;inconnu&quot; pour le type de l&#39;échantillon. </li></ol></li><li> Pour chaque mélange de 100 ul d&#39;agrégation, ajouter 98 ul de tampon d&#39;agrégation et 2 pi 3 mM thioflavine T. Pipeter plusieurs fois pour mélanger. </li><li> Transférer la totalité du mélange dans une cuvette (FCA3, dimension extérieure, lx L xh = 12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm). Placez la cuve dans le porte-échantillon de l&#39;échantillon compartiments et fermer le couvercle. Cliquez sur Exécuter pour recueillir les données de fluorescence. Enregistrer les données. </li><li> Retirer la cuvette et décanter la solution. Rincer la cuvette d&#39;eau distillée par trois fois. Sec par soufflage d&#39;air à l&#39;intérieur et l&#39;extérieur de la cuvette. </li></ol> 3. Avec-dye, mode continue Assay sur un lecteur de plaque SpectraMax M2 REMARQUE: Cet essai diffère du précédent en ce que le colorant fluorescent ou ThT ThS est inclus dans le totalisationréaction de tion. Ceci permet la mesure en continu de la même série de réactions. En raison de l&#39;utilisation répétitive de la réaction, ce procédé est mieux fait avec un lecteur automatique de plaque multi-puits (voir ci-dessous le fonctionnement du SpectraMax M2). Fluoromètre ordinaire fonctionne également, mais la fréquence de mesure des réactions d&#39;agrégation rapide est quelque peu limitée en raison de la nature de l&#39;opération manuelle. <ol><li> Mettre en place le mélange d&#39;agrégation dans une plaque de 96 puits (96 puits plaque noire solide, bien volume 360 pi, fond plat) comme dans le tableau 2. Chaque colonne représente les ingrédients nécessaires pour une réaction de 200 pi, ce qui est suffisant pour un temps de mesure point. Mélangez bien à la pipette plusieurs fois. Supplément frais DTT 1 mM chaque jour tout au long du cours d&#39;expériences. </li><li> Incuber la plaque à 96 puits à 37 ° C. </li><li> A chaque point de temps avant la mesure de la fluorescence, allumer le lecteur de microplaques multi-mode et l&#39;ordinateur. Prévoyez suffisamment de temps pour la MAchine à stabiliser, à environ 10 min. </li><li> Démarrez le logiciel sur l&#39;ordinateur. Réglez la température à 37 ° C et choisissez le mode Intensité de fluorescence (FI-Top Lire), réglez la longueur d&#39;onde d&#39;excitation à 450 nm et d&#39;onde d&#39;émission à 510 nm. </li><li> Insérez la plaque de 96 puits dans le tiroir et appuyez sur la touche READ pour démarrer la mesure. </li><li> Après avoir lu, retirez la plaque et le retourner à la 37 ° C incubateur. Copiez les données et coller dans un tableur Excel pour l&#39;analyse des données et de traçage. </li></ol> 4. Avec-dye, mode continue Assay sur une Spectrofluorometer Compact <ol><li> Mettre en place le mélange dans 1,5 ml agrégation des tubes Eppendorf comme dans le tableau 3. Chaque colonne représente les ingrédients nécessaires pour une réaction de 200 ul, ce qui est suffisant pour une mesure de temps de consigne. </li><li> Inverser le tube quelques fois pour mélanger. </li><li> Allumez le spectrofluorimètre et configurer le logiciel comme dans les étapes 2.3 et 2.4. </li><li> Transférer le mélange tout l&#39;étécuvette oa. Placez la cuve dans le porte-échantillon de l&#39;échantillon compartiments et fermer le couvercle. Cliquez sur Exécuter pour recueillir les données de fluorescence. Enregistrer les données. </li><li> Continuer la lecture à des intervalles appropriés en cliquant sur ​​Exécuter et enregistrer les données. Si l&#39;agrégation doit être surveillé à une fréquence élevée (par exemple, tous les 30 ou 60 secondes), laissez la réaction dans la cuve et dans la machine jusqu&#39;à ce que la mesure est terminée, ou quand il ya suffisamment de temps pour échanger des réactions ou des cuvettes. </li><li> Retirer la cuvette et décanter la solution. Rincer la cuvette d&#39;eau distillée par trois fois. Sec par soufflage d&#39;air à l&#39;intérieur et l&#39;extérieur de la cuvette. </li></ol>

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Ce protocole démontre différentes conditions et les instruments qui détectent les tau rapide cinétique d&#39;agrégation de phosphorylation dépendante dosage. Dans l&#39;essai du terminal, la fluorescence ThT colorant est ajouté à une partie de la réaction présente dans le mélange maître à chaque point de temps. Amyloïde liaison induite par fluorescence est ensuite mesurée 26. Dans le second, avec le mode de colorant, l&#39;agrégation de la protéine tau est effectuée en présence de ThT ou Th...

La maladie d&#39;Alzheimer (MA) est une d&#39;une grande collection de maladies neurodégénératives appelées tauopathies. La quintessence tauopathie pathologie sous-jacente est les enchevêtrements neurofibrillaires, NFT, dans les neurones, les astrocytes et la microglie 1-4. La densité NFT corrélation avec déficience cognitive 3,5 et neurone perte de 6. NFT contient la protéine tau hyperphosphorylée principalement (dénommé «p-tau&quot; désormais) qui forme des filaments hélicoïdaux appariés ou droites (NP) de 7,8. Tau est une protéine associée aux microtubules pensé pour faciliter le transport axonal qui est essentiel pour la signalisation neuronale et le trafic 9,10. Chaque molécule de tau contient 2-3 phosphates dans le cerveau normal, mais le contenu phosphoryle augmente de plusieurs plis chez les patients tauopathie 11. Kinases multiples sont susceptibles de contribuer à l&#39;hyperphosphorylation de tau y compris GSK3ß (glycogène synthase kinase 3β) et CDK5 (cycline-dekinase pendant 5) 12,13, mais la détente directe pour la phosphorylation pathologique reste insaisissable 14. Phosphorylation anormale dans ou à proximité des motifs de liaison aux microtubules se dissocie de la protéine tau des microtubules 15, et provoque une mauvaise localisation tau dans le compartiment somato-dendritique, où p-tau oligomérise en filaments hélicoïdaux appariés droites ou qui peuvent éventuellement se polymériser en inclusions NFT. Le lien étroit entre l&#39;hyperphosphorylation de tau, la formation NFT, et la neurodégénérescence conduit à une hypothèse répandue que les enchevêtrements p-tau provoquent des réponses cytotoxiques apoptotiques et autres, et est donc la cause sous-jacente de la neurodégénérescence tauopathie 16,17. écrans de médicaments et de tests cliniques précoces basés sur cette prémisse ont été lancés 18. Cependant, cette hypothèse doit relever des défis 19,20. Par exemple, SantaCruz et al. Ont montré que les fonctions cognitives des souris transgéniques peuvent être améliorées par la suppression de l&#39;expression d&#39;un mutanttau humaine, même si NFT continué à se former à partir de molécules tau existants 21. Dans un modèle chez la drosophile, NFT a été montré pour séquestrer la protéine tau cytosolique toxique pour protéger les cellules neuronales 22,23 sous-jacentes. De toute évidence, le rôle de la pathogenèse des NFT, le cas échéant, aura un grand impact la direction du développement des thérapies tauopathie. À des concentrations élevées, la protéine tau recombinante cerveau ou normal spontanément, mais lentement polymérise en une structure analogue à PHF in vitro, comme indiqué par la liaison de plusieurs feuilles β colorants fluorescents préférés, microscopie électronique, spectroscopie de diffusion de lumière et de 24 à 27. Ajout de l&#39;héparine ou de l&#39;acide arachidonique, un acide gras abondant dans le cerveau humain, accélère considérablement la formation de PHF et en tau isoform- inducteur concentration-dépendante manières 28-32. Curieusement, tau hyperphosphorylée purifié à partir de cerveaux AD ou préparé par exhaustive dans les réactions de phosphorylation in vitro uneggregates rapidement et plus efficacement 26,33-35. Ces résultats sont en excellent accord avec les rôles pathologiques de p-tau. Un système in vitro basée sur l&#39;agrégation des p-tau peut donc servir comme un outil puissant pour le dépistage de la drogue AD. Étant donné l&#39;association étroite entre l&#39;agrégation de la protéine tau et de la neurodégénérescence progressive de la MA, ainsi que le récent échec dans le développement de médicaments ciblant la plaque Aß, un autre marqueur histologique clé de AD 36-38, l&#39;intérêt pour la découverte de médicaments qui contrôlent l&#39;agrégation de la protéine tau est en hausse. En effet, plusieurs groupes ont déjà commencé écrans de drogue au débit différente, en utilisant dans les réactions d&#39;agrégation de tau in vitro que le test primaire. Un certain nombre de produits chimiques ont été trouvés à exposer activités inhibitrices ou inversion sur l&#39;agrégation de la protéine tau in vitro 39-42. Cependant, tous les écrans actuels de régulation de l&#39;agrégation de la protéine tau utilisent tau non modifiée qui rate la marque pathologique clé de phosphoreylation, soulevant une préoccupation pour la spécificité et l&#39;efficacité de l&#39;utilisation de ces composés dans le traitement de la MA. Un des obstacles majeurs de développement de tests d&#39;agrégation pour la caractérisation biochimique et le dépistage des drogues AD est la production de quantités suffisantes de la protéine tau hyperphosphorylée pathophysiologiquement pertinente. Utilisation du système de catalyse Zippers-assistée dans lequel l&#39;isoforme de la protéine tau et 1N4R la kinase GSK-3β sont co-exprimées dans E. coli comme protéines de fusion de glissière à leucine, nous avons surmonté ce défi (. Sui et al, soumis; voir la figure 1 pour les produits finaux de la protéine tau et p-tau; voir aussi 43 pour préliminaire spectrométrie de masse caractérisation de p-tau). D&#39;un panel de neuf anticorps spécifiques des différents sites de phosphorylation de la protéine tau, des signaux positifs ont été observés dans huit positions (données non présentées). Ci-dessous, nous décrivons les protocoles et instrumentations qui peuvent se différencier l&#39;agrégation d cinétiqueifferences entre la protéine tau non modifié et des espèces de p-tau. Ces essais ont été modifiés par des protocoles publiés qui ont mesuré l&#39;augmentation de la fluorescence de la thioflavine T (THT) ou la thioflavine S (SAT) sur amyloïdes (agrégats de tau) contraignant 26. Dans le premier &quot;terminal&quot;, approche sans colorant, les réactions d&#39;agrégation sont assemblés et mis en incubation en l&#39;absence du colorant amyloïde. A différents points dans le temps, une partie aliquote de chaque réaction est enlevé et mélangé avec un volume égal du tampon THT-contenant et pour empêcher l&#39;agrégation ThT permettre de lier des agrégats de la protéine tau. La fluorescence est mesurée par un IAP FluoroMax-2 fluoromètre. Dans le second &quot;avec colorant&quot; test de surveillance continue, ThT ou ThS est inclus dans les réactions d&#39;agrégation. Fluorescence peut être mesurée en continu tout au long de toute l&#39;expérience manuellement ou en utilisant un lecteur multi-plaque. En outre, nous décrivons un essai qui utilise une concentration quasi-physiologique de la protéine tau et la protéine tau de p-agrégation dans le mo de mesure continuellede. L&#39;effet de la phosphorylation reste facilement détectable. Ci-dessous, nous allons décrire les procédures étape par étape opération, et de montrer des résultats représentatifs de ces essais. Discussion de certains des avantages et inconvénients de chaque approche, ainsi que les applications potentielles de dépistage de drogue suivront. À une concentration élevée, tau agrégats d&#39;amyloïde dans les structures en forme spontanément. Toutefois, dans le laboratoire, tau fibrilles est généralement accélérée par ces inducteurs comme l&#39;héparine (poids moléculaire moyen, 6000 g / mol) et l&#39;acide arachidonique. Des exemples indiqués ici comprennent 30 uM héparine. La formation d&#39;agrégats amyloïdes tau est contrôlée par la fluorescence résultant de la liaison de thioflavine T (ThT) ou la thioflavine S (SAT) amyloïde. Lors de la liaison à des agrégats de tau, ThT présente un décalage vers le rouge de la fluorescence (excitation: 450 nm; le pic d&#39;émission: 485 nm). ThS, d&#39;autre part, a faible émission à 510 nm (excitation à 450 nm) avant de se lier amyloïde, mais cette fluorescence augmente de façon significative en présence d&#39;une protéine amyloïde tels que le tau agrégée 44. Les deux colorants fonctionnent bien dans la détection de l&#39;agrégation de la protéine tau et p-tau. En raison de la forte pointe d&#39;émission relativement large et de ThT (voir la figure 2), il n&#39;y a qu&#39;une réduction de 30% dans l&#39;unité de fluorescence à 510 nm. Pour plus de commodité, nous utilisons la même combinaison de longueurs d&#39;onde d&#39;excitation / émission (ce est à dire, 450 nm / 510 nm) pour surveiller l&#39;agrégation de la protéine tau en utilisant soit colorant. l&#39;agrégation de tau peut être effectuée en présence ou en l&#39;absence du colorant, en fonction du but de l&#39;essai et de la disponibilité de la protéine tau. Les deux modes de réactions sont présentés ci-dessous. En outre, nous démontrons l&#39;exploitation de deux instruments différents - un seul échantillon fluoromètre (ISA-SPEX FluoroMax-2) et un lecteur multi-plaque (SpectraMax M2). Les lecteurs devraient être en mesure d&#39;adapter ces protocoles pour répondre à leurs besoins spécifiques et de la disponibilité de l&#39;instrument.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="449">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:103px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Trizma&#160;base</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1503</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">MAL-7581-06</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15576-028</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T3516</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin S</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1892</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:116px;">heparin</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">H3393</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">D9779</td>
			<td style="width:103px;">Stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">96-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:103px;">3917</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">ISA SPEX FluoroMax-2</td>
			<td style="width:128px;">Horiba</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:116px;">SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td>
			<td style="width:128px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:128px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:103px;">MAB3494</td>
			<td style="width:103px;">Stored at &#8211;80&#176;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Utilisation recombinant tau et p-tau (Figure 1), nous avons établi deux protocoles différents pour comparer la cinétique de l&#39;agrégation de la protéine tau et p-tau, en profitant de la forte émission de fluorescence de ThT et ThS lors de la liaison à amyloïde agrégats de protéines, y compris la protéine tau et p-tau (Figure 2). Avec ou sans le colorant fluorescent dans la réaction d&#39;agrégation, nous avons observé l&#39;amélioration constante de l&#39;agrégation d...

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In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Protéines tau non modifiées et hyperphosphorylées ont été utilisés dans deux des essais in vitro de l&#39;agrégation de révéler la cinétique d&#39;agrégation rapide hyperphosphorylation-dépendante. Ces dosages ouvrent la voie à de futurs écrans composés qui peuvent moduler la propension de la protéine tau hyperphosphorylée pour former des fibrilles qui sous-tendent la progression de la maladie d&#39;Alzheimer.

In Vitro agrégation essais utilisant la protéine tau hyperphosphorylée

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

18.2K vues.  Michigan State University.  Protéines tau non modifiées et hyperphosphorylées ont été utilisés dans deux des essais in vitro de l'agrégation de révéler la cinétique d'agrégation rapide hyperphosphorylation-dépendante. Ces dosages ouvrent la voie à de futurs écrans composés qui peuvent moduler la propension de la protéine tau hyperphosphorylée pour former des fibrilles qui sous-tendent la progression de la maladie d'Alzheimer. 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

L&#39;adhésion des plaquettes et l&#39;agrégation sous flux en utilisant des cellules de débit microfluidique

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Homogène de détection rapide des essais biologiques utilisant un support magnétique Système de modulation Biosensing

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analyse de Schwann-astrocytes interactions à l&#39;aide In Vitro Tests

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D imagerie de l&#39;agrégation des protéines dans les cellules vivantes

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro test de Méthylation à étudier des protéines méthylation de l&#39;arginine

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...