Cette méthode permettra aux chercheurs de quantifier la dynamique précoce de l’adhérence cellulaire et la propagation des cellules dépendantes de l’ancrage sur la fibronectine protéique de matrice extracellulaire pendant le stress oxydatif. Cette technique est polyvalente et peut être adaptée pour examiner la dynamique cytosquelettique dans un large éventail de conditions. En outre, l’acquisition et l’analyse de données sont effectuées à l’aide d’équipements de laboratoire communs et de logiciels disponibles gratuitement.
Comprendre les mécanismes de fixation et de propagation des cellules sur l’ECM lors des altérations du statut redox peut fournir un aperçu précieux des états normaux et de la maladie, tels que le cancer métastatique. Cette méthode peut être utilisée pour examiner la propagation cellulaire et l’adhérence dans différentes conditions de culture cellulaire, les lignées cellulaires dépendantes de l’ancrage et/oxydants pour répondre à un large éventail de questions biologiques. Il y a de nombreux reagents requis pour exécuter cette technique.
Par conséquent, il est essentiel que toutes les solutions soient apportées à l’avance avant de commencer. Dans une hotte d’écoulement laminaire certifiée BSL-II, une plaque de 24 puits certifiée culture tissulaire a été mise en place. Placez un couvercle en verre dans chaque puits.
Étiquetez la plaque selon la figure 1B du protocole de texte. Ensuite, pipette 500 microlitres de la solution fibronectine dans chaque puits. Pipette la solution sur chaque coverslip à quelques reprises pour assurer un revêtement même et une submersion complète.
Couvrir la plaque avec le couvercle. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Retirez ensuite la plaque de l’incubateur et aspirez la solution fibronectine des puits.
Lavez les puits trois fois à l’aide de 500 microlitres de 1X PBS par lavage. Aspirez le lavage final de 1X PBS, et bloquez les puits avec 500 microlitres d’une solution BSA délipidée à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins 15 minutes. Tout d’abord, préchauffer les solutions nécessaires dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius.
Dans un capot d’écoulement laminaire certifié BSL-II, commencez par un monocouche confluent de cellules REF52 dans un plat de 10 centimètres carrés et lavez les cellules deux fois avec six millilitres de 1X PBS chaud. Le sérum affamer les cellules pendant au moins une heure dans six millilitres de solution chaude de BSA délipidée. Ensuite, lavez les cellules avec six millilitres de 1X PBS réchauffé.
Aspirez le PBS et ajoutez 1,5 millilitres de solution warm 0.5%trypsin-EDTA. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant environ deux minutes. Observez les cellules au microscope léger pour vous assurer que le détachement est terminé.
Si les cellules sont toujours adhérentes après avoir tapé la plaque sur le dessus du banc, retournez-les à l’incubateur pendant deux minutes supplémentaires. Pipette 1,5 millilitres de trypsine chaude neutralisant la solution, TNS, au plat pour arrêter la trypsinisation et recueillir les cellules détachées. Pipette la solution de haut en bas sur le fond de la plaque de nombreuses fois pour enlever toutes les cellules adhérentes restantes.
Si les cellules semblent agglutinées, triturer davantage la suspension cellulaire en évadant doucement de haut en bas à l’arrière du plat. Ensuite, comptez les cellules à l’aide de l’exclusion bleue trypan dans un compteur cellulaire automatisé. Enlevez une quantité appropriée de cellules pour créer une suspension cellulaire avec la densité cellulaire entre 10 000 et 30 000 cellules par millilitre dans un tube conique délipidé de 15 millilitres.
Utilisez un rotor à angle fixe dans une centrifugeuse de table pour centrifuger les cellules à 300 fois g pendant cinq minutes. Aspirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire en sept millilitres de solution BSA délipidée chaude. Divisez ensuite uniformément la suspension cellulaire en deux tubes coniques de 15 millilitres, l’un pour le contrôle seul du véhicule, et l’autre pour ku55933.
À l’aide d’un rotateur à tube, tournez les tubes pendant 90 à 120 minutes dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius. 30 minutes avant le placage, ajouter ku55933 et DMSO à chaque tube à une concentration finale de 10 micromolaires. Retourner la suspension cellulaire dans le rotateur pour le temps restant.
Immédiatement avant le placage des cellules, récupérer la plaque de l’incubateur et aspirer la solution BSA délipidée. Après cela, retirez 500 microlitres de la suspension cellulaire de chaque groupe de traitement et ajoutez-les à l’un des bordereaux de couverture enduits de fibronectine dans la plaque de 24 puits. Continuer à couver la plaque et la suspension cellulaire aux conditions précédentes.
Ensuite, laissez les cellules adhérer à la couverture pour la durée désirée. Après le temps désiré pour l’adhérence a passé, aspirer la solution cellulaire de chaque coverslip dans la plaque. Distribuez délicatement 500 microlitres de solution de paraformaldéhyde de 3,7 % sur chaque glissement de couverture en déformant les côtés des puits et attendez de 10 à 15 minutes.
Ensuite, retirez la solution de paraformaldéhyde et lavez chaque coverslip deux fois avec 1X PBS à l’aide de 500 microlitres de PBS par lavage. Aspirer le PBS et les cellules permeabilisées sur chaque coverslip avec 500 microlitres de 0,2%Triton X-100 et 1X PBS pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Lavez ensuite chaque coverslip trois fois avec 1X PBS à l’aide de 500 microlitres de PBS par lavage.
Bloquez les cellules sur chaque coverslip avec 500 microlitres de tampon bloquant l’immunofluorescence pendant 30 à 60 minutes. Diluer l’anticorps anti-paxilline primaire dans le tampon de blocage à un rapport de un à 250. Bien mélanger et ajouter 200 microlitres de la solution anticorps à chaque coverslip.
Incuber à température ambiante pendant au moins une heure. Après cela, aspirer la solution anticorps et laver chaque coverslip avec 500 microlitres de 1X PBS pendant 10 minutes. Protégez les échantillons de la lumière à partir de ce point vers l’avant.
Diluer la sonde Phalloidin F-actin conjuguée au colorant fluorescent rouge Alexa 594 et à l’anti-souris de chèvre 488 anticorps secondaire fluorescent dans la même solution tampon de blocage. Bien mélanger et ajouter 200 microlitres de la solution anticorps à chaque coverslip pendant 30 minutes. Aspirez la solution d’anticorps et lavez chaque coverslip avec 500 microlitres de 1X PBS pendant 10 minutes.
Aspirez le PBS et rincez les feuillets de couvercle une fois avec 500 microlitres d’eau déionisée. Ensuite, fixez les feuillets de couverture sur des glissières de microscope à l’aide d’un support de montage anti-fondu contenant du DAPI. Après fixation et coloration avec un anticorps anti-paxillin, des images fluorescentes à échelle grise de 8 bits des cellules REF52 sont acquises.
À la fin de toutes les étapes de traitement d’image, les adhérences focales individuelles doivent être importantes, au point et facilement discernables les unes des autres. Les images de fluorescence grayscale d’anti-paxilline et de phalloidin F-actin sondent les cellules souillées sont alors prises après avoir été plaquées sur la fibronectine. Les adhérences focales proéminentes et les fibres de stress devraient être facilement visibles dans les cellules REF52 après avoir été autorisés à adhérer à la fibronectine pendant 20 à 30 minutes.
Les volants enrichis en F-actine au bord d’attaque des membranes cellulaires sont indiqués avec une flèche. Des images fluorescentes similaires de la sonde F-actine de phalloidin et de la coloration d’anti-paxillin sont analysées pour le pourcentage de fibres de stress dans la diffusion cellulaire. Notamment, le traitement oxydant provoque une augmentation significative de la formation de fibres de stress à tous les points de temps d’adhérence examinés, et une diminution de la propagation cellulaire après 15 minutes d’adhérence cellulaire à la fibronectine.
Le placage à des densités cellulaires plus élevées conduit à l’encombrement cellulaire qui interdit aux cellules de se propager complètement en raison de la surconfluence. Notez que les bords des cellules sont indiscernables des cellules adjacentes. Par conséquent, la quantification des cellules individuelles est exclue et la circonférence de propagation ne peut être déterminée avec précision.
Une lignée cellulaire distincte de fibroblastes embryonnaires de souris sont maintenus en suspension, puis plaqués sur la fibronectine pendant 30 minutes. Les cellules ont ensuite été fixées et tachées d’un anticorps anti-paxillin. Notez les cellules non focales.
En outre, la réactivité croisée de l’anticorps anti-paxilline avec débris cellulaires modifiera le seuil lors de l’analyse quantitative de l’image et ne devrait pas être incluse dans l’analyse. Pendant le traitement de l’image, utilisez l’outil de recherche aux Fidji pour examiner l’histogramme d’image tout en ajustant la luminosité/contraste pour éviter les pièges liés à la saturation du signal. Les changements dans l’adhérence et la propagation peuvent influencer la migration cellulaire.
Les méthodes de suivi de la migration d’une seule cellule, de la cicatrisation des plaies ou des analyses d’invasion de chimiotaxis peuvent déterminer si des changements dans la migration se produisent. Les GTPases de la famille Rho régulent la dynamique d’adhérence cellulaire par leur activation temporelle spatiale spécifique. Les changements phénotypiques dans l’adhérence et la propagation pendant le stress oxydatif peuvent être suggestifs des rôles réglementaires en aval pour ces protéines.
Cette méthode nécessite l’utilisation de lignées cellulaires BSL-II et de réagenouillements chimiques dangereux. Les chercheurs ont besoin d’une formation en sécurité chimique et biologique déterminée par le bureau de la santé et de la sécurité environnementales de leur établissement.
