La méthode aide à l’étude de la signalisation mécanique des cellules de la crête neurale et de son interaction avec les signaux chimiques. Il peut également aider dans les mécanismes moléculaires et génétiques du développement de la crête neurale dans les maladies. Transférer les glissières de couvercle en verre est le plus difficile, donc les transférer lentement et attentivement pour éviter de les casser et de les laisser tomber.
La démonstration de la procédure sera faite par moi et la Dre Sherry Zhao, boursière postdoctorale de mon laboratoire. Commencez par placer le nombre souhaité de couvercles de verre glissés sur un morceau de lingette de laboratoire. Ensuite, stérilisez chaque couvercle en le passant d’avant en arrière à travers la flamme du brûleur à alcool.
Lorsque le couvercle glisse refroidit, couvrez le couvercle de 12 millimètres avec environ 200 microlitres et le couvercle de 25 millimètres avec 800 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire. Après cinq minutes, aspirer l’hydroxyde de sodium et laisser sécher à l’air libre pendant cinq minutes les glissements de couverture pour former un film uniforme. Une fois les feuillets de couverture séchés, ajoutez environ 18 microlitres de triéthoxysilane d’aminopropyle ou d’APTS sur un bordereau de couverture de 12 millimètres et 150 microlitres d’APTS sur un bordereau de couverture de 25 millimètres.
Aspirer l’APTS d’accès pour permettre à l’APTS résiduel de sécher pendant cinq minutes. Plus tard, rincez les couvercles trois fois en les immergeant dans de l’eau désionisée stérile pendant cinq minutes à chaque fois. Déplacez les couvercles lavés vers une boîte de Petri fraîche avec le côté réactif vers le haut.
Et traitez les glissements de couverture en trempant suffisamment de glutaraldéhyde à 0,5% pendant 30 minutes. Après avoir aspiré le glutaraldéhyde, rincez une fois le couvercle avec de l’eau désionisée pendant trois minutes et séchez à l’air le couvercle glisse avec le côté réactif vers le haut. Pour préparer les bordereaux de couverture siliconés, placez le même nombre de bordereaux de couverture que ce couvercle enduit d’aminosilane glisse dans une boîte de Petri recouverte de film para.
Ensuite, traitez les feuillets de couverture de 12 millimètres avec 40 microlitres et les feuillets de couverture de 25 millimètres avec 150 microlitres de dichlorométhane silane ou de DCMS pendant cinq minutes. Lavez les feuillets de couverture avec de l’eau désionisée stérile une fois pendant une minute avant de placer les glissières réactives face vers le haut sur une lingette de laboratoire. Pour préparer les hydrogels, pipettez la solution de gel d’acrylamide fraîchement préparée sur les feuillets de couverture enduits d’aminosilane séchés.
À l’aide d’une pince à épiler incurvée, transférez immédiatement le bordereau de couverture traité DCMS sur le dessus de la solution de gel avec le côté traité touchant la solution de gel, changeant ainsi la solution de gel entre deux glissements de couverture. Une fois le gel polymérisé, séparez le couvercle traité DCMS par une pince à épiler incurvée, en laissant le gel attaché au couvercle recouvert d’aminosilane. Ensuite, immergez le couvercle de 12 millimètres avec l’hydrogel attaché dans une plaque prédéterminée de 4 ou 24 puits recouverte de 500 microlitres de PBS stérile ou d’eau désionisée et le couvercle de 25 millimètres glisse dans une plaque de 6 puits recouverte de deux millilitres de PBS stérile ou d’eau désionisée pendant 30 minutes.
Après avoir retiré l’excès de solution d’acrylamide, conservez les hydrogels dans du PBS stérile ou de l’eau désionisée à température ambiante pendant 30 minutes. Plus tard, aspirez le PBS ou l’eau désionisée de la plaque de puits avant d’ajouter la solution de Sulfo-succinimydyl ou de Sulfo-SUNPAH pour couvrir complètement le gel. Et placez les gels avec la solution sous une lumière ultraviolette de 15 watts et 365 nanomètres à découvert pendant 10 minutes.
Collectez autant de Sulfo-SANPAH par solution que possible en inclinant la plaque. Et puis lavez le gel deux à trois fois avec 15 millimolaires HEPES. Ajouter 15 milligrammes par millilitre de collagène 1 dilué dans de l’acide acétique à 0,2% à chaque puits contenant l’hydrogel.
Et incubez les gels pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, effectuez le lavage comme décrit dans le manuscrit avant d’incuber les hydrogels avec du PBS contenant 10% de sérum de cheval et 5% de FBS à 37 Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après deux heures d’incubation, ajoutez 500 microlitres de DMEM stérile filtré avec 10% de FBS et 1% de streptomycine de pénicilline à chaque puits et stockez les gels à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Lorsque la culture cellulaire est prête, plaquer environ 1,5 fois 10 à la quatrième 09-1 cellules par centimètre carré dans le milieu bazell. Utilisez une pince à épiler pour transporter les glissements de couverture vers une nouvelle plaque afin de minimiser les faux signaux provenant des cellules cultivées directement sur la plaque. Ensuite, fixez les cellules en utilisant 500 microlitres de 4% de paraformaldéhyde pendant 10 minutes avant de traiter les cellules avec 500 microlitres de 0,1% triton X-100 à température ambiante.
Après 15 minutes, marchez les cellules avec 250 microlitres de sérum d’âne à 10%. Colorez les cellules pour la F-actine avec la félodipine à une dilution de 1 à 400 dans 250 microlitres de sérum d’âne à 10%, suivie d’une incubation avec DAPI pendant 10 minutes. Lavez les cellules avec du PBS pendant deux minutes avant d’ajouter trois à quatre gouttes de milieu de montage à chaque puits.
Sur un microscope à fluorescence, capturez les images d’au moins trois images aléatoires par échantillon d’hydrogel produisant des canaux individuels et fusionnés. Dans l’évaluation de la rigidité de l’hydrogel par microscopie à force atomique ou AFM, la pente de la courbe de force était douce pour les hydrogels mous car la force requise de la sonde AFM était moindre. Cependant, sur les hydrogels rigides, la pente générée était beaucoup plus raide.
Les mesures AFM ont ensuite été utilisées pour calculer la rigidité moyenne des hydrogels à partir du module d’élasticité de Young en kilopascals. Les caractéristiques de croissance des cellules P19 et 09-1 ont été observées dans des hydrogels d’un kilopascal et de 40 kilopascals de systèmes de contrôle et de gel modifié. Les cellules 09-1 cultivées sur les systèmes de gel d’origine ont entraîné un nombre plus élevé de cellules mortes.
En revanche, les cellules 09-1 cultivées sur les systèmes de gel modifiés présentaient une croissance cellulaire saine et une fixation suffisante au substrat des hydrogels avec peu de pont cellulaire indiqué par un minimum de cellules rondes. Les cellules P19 plaquées sur les deux systèmes d’hydrogel présentaient un excès de cellules flottantes rondes et un manque de fixations de substrat cellulaire. La compatibilité des cellules de la crête neurale ou des CCN avec le système d’hydrogel modifié a été évaluée par coloration immunofluorescente de l’AP-2.
Une augmentation significative de l’expression de l’AP-2 dans les cellules 09-1 plaquées sur le système d’hydrogel modifié a été observée. De plus, les cellules 09-1 présentaient des morphologies différentes basées sur les hydrogels de rigidité faible ou élevée à travers des quantités variables de fibres de stress. L’expression de l’anti-vinculine dans les cellules 09-1 cultivées sur l’hydrogel de 40 kilopascals était plus élevée que dans l’hydrogel d’un kilopascal, ce qui reflète le fait que les cellules cultivées sur des substrats plus mous forment des complexes d’addition focale minimes que le substrat rigide.
Un temps d’attente approprié est crucial pour la polymérisation des hydrogels car les acrylamides sont toxiques pour les cellules. Immergez les hydrogels dans du PBS ou de l’eau désionisée pendant au moins 30 minutes pour assurer de meilleurs résultats.
