Le cœur contient une population hétérogène de cellules immunitaires qui jouent un rôle crucial dans l’inflammation cardiaque ainsi que la réparation. Afin de comprendre l’hétérogénéité des cellules immunitaires et d’obtenir un meilleur aperçu de leur fonction, il est important d’avoir une méthode qui permettra la récupération de ces cellules du cœur. Cette technique peut aider à découvrir la diversité cellulaire immunitaire ainsi que non immunisée qui réside dans le cœur sain ou maladie.
Cette technique présente trois avantages majeurs. Tout d’abord, il s’agit d’un flux de travail simple qui conduit à la génération de suspension cellulaire unique de différents types de cellules dans les trois heures suivant. Deuxièmement, il conduit à un rétablissement élevé des populations viables de cellules immunitaires et non immunes.
Et troisièmement, c’est une méthode très polyvalente et peut être appliquée sur les tissus cardiaques chez d’autres espèces ainsi. Il est important de prêter attention à la quantité de tissu utilisée pour une seule réaction de digestion. Utilisez des ciseaux stériles, disséquez le spécimen de tissu de la paroi apical ou latérale du ventricule gauche dans la solution saline froide ou HBSS.
Disséquer soigneusement la graisse épicurienne et chordae tendineae du spécimen. À l’aide d’une lame stérile ou de ciseaux, disséquer les morceaux de tissu en morceaux pesant environ 200 milligrammes. Après avoir euthanasié la souris, ouvrez la cavité thoracique à l’aide de ciseaux pointus.
Utilisez des hémostats contondants pour soulever le cœur vers le haut. Imprènuez le cœur avec du PBS froid à l’aide d’une aiguille de calibre 25 fixée à une seringue de cinq millilitres. Perfuser jusqu’à ce que le cœur semble blanchi en couleur.
Retirer le cœur et le placer dans une boîte de Pétri stérile sur la glace. Placer 200 milligrammes de tissus cardiaques humains ou de cœur murin dans une boîte de Pétri stérile. Hacher finement le tissu à l’aide d’une lame stérile ou de ciseaux.
Pour mettre en place des digestions, dans un tube conique de 15 millilitres, préparer un volume de digestion final de trois millilitres pour chaque morceau de tissu cardiaque humain ou un cœur murin avec des enzymes collagène I, DNase I, et hyaluronidase à des concentrations de 450, 60 et 60 unités par millilitre. Ajouter 2,5 millilitres de DMEM dans le tube. À l’aide de forceps propres, placez le tissu finement haché dans chaque tube de réaction.
Bien mélanger par vortex doux. Digérer pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un incubateur secouant réglé à une vitesse d’agitation faible à moyenne. Après une heure de digestion, sortir les tubes de l’incubateur et les placer sur la glace.
Installez des tubes coniques de 50 millilitres avec une passoire cellulaire de 40 microns sur le dessus. Mouiller les filtres avec deux millilitres d’enzyme désactivant tampon. Ensuite, désactivez les enzymes de digestion en ajoutant huit millilitres d’enzyme désactivant tampon à chaque tube de digestion.
Versez ensuite les 13 millilitres de mélange total résultant à travers la passoire cellulaire de 40 microns dans les tubes coniques de 50 millilitres. Transférez les échantillons filtrés dans des tubes coniques frais de 15 millilitres. Faites tourner les échantillons à 400 fois g pendant six minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez le supernatant en laissant 0,5 millilitres de médias. Resuspendez la pastille cellulaire par pipetting doux et ajoutez un millilitre de tampon de lyse d’ACK. Faites tourbillonner doucement le tube et incubez à température ambiante pendant cinq minutes pour effectuer la lyse des globules rouges.
Après cinq minutes dans le tampon ACK, ajouter neuf millilitres de DMEM à l’échantillon. Remettre le couvercle sur les tubes et inverser délicatement les tubes pour mélanger. Filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 microns et recueillir le filtrate dans des tubes coniques de 15 millilitres.
Centrifuger les tubes à 400 fois g pendant six minutes et jeter le supernatant. Ajouter un millilitre de tampon FACS et resuspendre la pastille. Ensuite, transférez-le dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Centrifugeuse à nouveau à 400 fois g pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans 100 microlitres de tampon FACS. Une suspension à cellule unique est maintenant prête pour la coloration des anticorps.
Ajouter un panneau d’anticorps humain typique aux échantillons de cœur à une à 50 dilution. Utilisez différents anticorps pour les cellules stromales et les macrophages cardiaques murins. Incuber de 30 à 40 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.
Ajouter un millilitre de tampon FACS, doucement vortex et centrifugeuse à 400 fois g pendant cinq minutes. Répétez cette étape de lavage une deuxième fois. Puis résuspendez l’échantillon en 350 microlitres de tampon FACS et ajoutez dapi pour atteindre une concentration finale d’un micromolaire.
Les échantillons sont maintenant prêts pour l’analyse facs. Dans ce protocole, l’isolement des macrophages de la souris et du myocarde humain a été réalisé. Ce chiffre montre le noyau humain non traité et traité de LVAD.
Le schéma de gating pour le tri de flux des macrophages humains négatifs et CCR2 positifs de CCR2 du myocarde humain aussi bien que pour des cellules stromal négatives de CD45 de la cardiomyopathie ischémique humaine ont été présentés. Les images de Wright taché FACS triés CD45 positif et CD45 cellules négatives montrent membrane cellulaire intacte indiquant la viabilité. Le schéma de gating pour trier les macrophages à partir d’un cœur de souris a également été un succès.
Le poids du tissu utilisé pour la réaction enzymatique est essentiel pour une digestion efficace. N’utilisez pas plus de 200 milligrammes de tissu pour les concentrations enzymatiques indiquées dans le protocole. Suivant cette méthode, les cellules peuvent être cultivés pour des analyses de stimulation in vitro.
Les cellules peuvent être triées pour le séquençage en vrac de l’ARN ou le séquençage à cellule unique. Cette méthode a servi de technique inestimable pour découvrir l’hétérogénéité macrophage précédemment non reconnue qui est présente dans le cœur humain sain ou maladie. En utilisant cette méthode suivie d’un séquençage à cellule unique, des études sont en cours pour découvrir comment diverses cellules immunitaires et non immunisées varient du cœur maladie au cœur sain.
