L’étude de la fonction génique et de la maladie est entravée par la nature de la population humaine. Les différents antécédents génétiques des lignées cellulaires iPS spécifiques au patient et de contrôle peuvent affecter l’efficacité de différenciation et les phénotypes trouvés dans un essai fonctionnel donné. L’utilisation de lignées génétiquement identiques ou isogéniques où la seule différence est la mutation particulière de l’intérêt est essentielle pour surmonter ces problèmes.
De nombreuses maladies humaines sont causées par des mutations hétérozygotes, qui peuvent être difficiles à générer avec le système CRISPR-Cas9. Ceci est dû à la génération de mutations indélébiles dans l’allèle non ciblé qui peuvent se produire à très haute fréquence. Notre technique surmonte ce problème en utilisant deux modèles de réparation dont un seul abrite la mutation d’intérêt.
Tout chercheur qui essaie cette technique devrait être habile dans la culture des cellules souches pluripotentes humaines. La démonstration vidéo de la cueillette des colonies sera utile pour montrer la taille et la morphologie correctes ainsi que la technique utilisée pour la cueillette et le dépistage. La démonstration de cette procédure sera Leo Cardenas.
Pour commencer, plaquez les ESC humains sur les CEM irradiés dans une plaque de 6 puits. Préparer le mélange maître transfection. Mélanger au pipetage et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
Lorsque les cellules atteignent 70 à 80%confluency, puis, ajouter le mélange maître transfection laisser tomber sage à chaque puits avec des cellules et incuber à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Changez les médias toutes les 24 heures. Pour récolter les cellules, d’abord, incuber les cellules avec Triple E pendant trois minutes à température ambiante pour enlever les MEF enzymatiquement.
Ajouter 0,5 millilitres de milieu HESC avec un inhibiteur rock de 10 micromolaires. Cellules de granulés à 300 fois g pendant trois minutes et re-suspendre dans 0.5 millilitres de milieu humain d’ESC avec l’inhibiteur de ROCHE de 10 micromolar. Filtrer la suspension cellulaire dans un tube de cinq millilitres à travers un bouchon de passoire cellulaire de 35 microns.
À l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence, portez les cellules vivantes et triez les cellules fluorescentes vertes positives aux protéines. Ensuite, transférez un maximum de 1,5 fois 10 aux quatre cellules triées directement dans un plat de 10 centimètres recouvert d’une à trois matrices membranaires du sous-sol et de MEFs irradiés et d’un milieu ESC humain contenant un inhibiteur rock. Changer de milieu tous les jours à l’aide du milieu esc humain sans inhibiteur ROCK.
Après 10 à 15 jours, les colonies mesurent environ un à deux millimètres de diamètre. Au microscope, utilisez une pipette P200 pour gratter soigneusement un seul clone et attirer les cellules dans la pipette. Dispersez les cellules dans un puits d’une plaque de 96 puits en pipetting doucement trois à quatre fois dans le milieu établi avec la colonie.
Ensuite, choisissez 20 colonies pour chaque ARN guide et distribuez-les dans des tubes à bande PCR pour le criblage. Pelleter les cellules par centrifugation à 10 000 fois G pendant cinq minutes. Maintenant, incuber des granulés cellulaires dans 20 microlitres de Proteinase K tampon pour isoler l’ADN et le vortex vigoureusement.
Centrifugeuse à 10 000 fois G pendant 5 minutes. Ensuite, effectuez le criblage pcr de l’ADN édité. Ajouter dans les tubes 20 microlitres d’un mix master, y compris les amorces avant et arrière, conçues pour amplifier la région d’intérêt, ainsi que cinq microlitres du digest Proteinase K.
Utilisez de l’ADN génomique isolé de la ligne iPSC de contrôle pour confirmer un amplicon propre lors de l’exécution du pcr de criblage. Évaluer les changements de taille des produits PCR après une heure d’électrophorèse à 70 à 90 volts sur un poids de 2,5% par gel d’agarose en volume. Toute différence de taille est révélatrice d’un clivage.
Pour transfecter l’ADN oligo à brin unique et les plasmides CRISPR-Cas9, plaquez la lignée cellulaire cible dans un plat de 6 puits sur les CEM irradiés pour atteindre 70 à 80% de confluence après une incubation d’une nuit. Configurer la réaction de transfection telle que décrite. Mélanger la réaction par pipetting et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
Ensuite, ajouter le mélange de réaction de transfection goutte sage pour les cellules. Après 48 heures, préparer les cellules pour le tri cellulaire comme précédemment. Environ 10 jours après le placage des cellules simples, utilisez une pipette de 200 microlitres pour ramasser des colonies dans des tubes à bandes PCR et dans un puits d’une plaque de 12 puits pré-enduite de gélatine et de MEFs.
Transférer 100 microlitres des cellules à chaque puits d’une plaque de 24 ou 48 puits, préalablement recouverte de gélatine et de MEFs irradiés dans le milieu esc humain avec inhibiteur de ROCK. Utilisez les 100 microlitres restants pour l’isolement de l’ADN. Pour vérifier l’intégration réussie de l’ADN oligo à brin unique, prenez cinq microlitres d’ADN isolés de chaque colonie pour effectuer la PCR à l’aide des amorces de criblage précédemment conçues.
Purifier les produits PCR et préparer les 40 microlitres de digestion des enzymes de restriction en utilisant le site enzymatique unique créé dans l’ADN oligo brin unique. Mélanger la réaction par pipetting et incuber à la température recommandée par le fabricant pendant une à trois heures. Ensuite, visualisez les produits PCR digérés ajoutés avec un colorant de chargement sur un poids de 1,5% par gel d’agarose de bromure d’éthidium de volume, électrophorese à 80 à 100 volts pendant 40 minutes.
Si l’intégration réussie de l’ADN oligo à brin unique s’est produite, séquencez des mutations spécifiques à l’aide d’une amorce imbriquée. Dans cette étude, pour la construction d’ARN de guide, une bande de paire de base de 100 a été excisée d’un gel d’agarose de 1,5%. Après transfection cellulaire, la validation de la coupe de l’ARN guide a été visualisée à l’aide d’un gel agarose de 2,5 %.
Un produit PCR de 180 paires de base a montré un contrôle non coupé et différents clones avec des décalages de bande indiquant la formation indélébile. Différents ARN de guide ont eu différentes efficacités de coupe. Pour éviter que CRISPR-Cas9 ne recoupe les allèles édités, la séquence PAM a été modifiée à l’aide d’une mutation silencieuse de G à A.
Une mutation silencieuse dans la séquence PAM a généré un site de restriction unique, qui aide à l’écran pour une intégration réussie dans un ou deux allèles. Les lignées de cellules souches éditées par génome peuvent être utilisées dans les différenciations en aval et les analyses fonctionnelles pour étudier l’effet d’une mutation donnée sur le développement humain et la maladie. Cette méthodologie permet la génération de lignées cellulaires isogéniques avec des mutations spécifiques hétérozygotes ou homozygotes, impliquées dans une grande variété de maladies humaines.
Ces modèles de maladies ouvrent la voie au développement de nouvelles thérapies cellulaires et offrent des plateformes de découverte de médicaments.
