Les éléments cis-réglementaires comme les promoteurs et les exhausteurs sont des déterminants clés de l’expression des gènes. Les approches traditionnelles pour étudier ces éléments sont laborieuses et impliquent souvent l’utilisation de gènes de reporter héterologiques. Ici, nous démontrons l’utilisation de CRISPR pour examiner le rôle transcriptionnel d’un silencieux intronique RUNX1 dans la lignée des cellules leucémiques.
Le protocole est simple à exécuter et permet des évaluations rapides des fonctions de régulation génétique dans le contexte génétique endogène. Les cellules hématopoïétiques sont souvent difficiles à transfecter avec des méthodes basées sur le plasmide. Dans ce protocole, nous utilisons l’électroporation pour livrer cas9 préassemblé, guide ARN, complexes dans les cellules.
Les avantages de cette approche incluent l’utilisation d’une efficacité d’édition et d’une viabilité cellulaire améliorées ainsi que la réduction des effets hors cible. En outre, l’utilisation ultérieure de l’analyse des fragments permet un criblage simple et rapide des clones mutants désirés à partir d’une grande quantité d’échantillons. Yuk-Lin Yung, technicien pour mon laboratoire, démontrera la procédure.
Commencez par concevoir deux ARN CRISPR, l’un cinq premiers et les trois autres premiers de l’élément cis-réglementaire cible, ou CRE. Assurez-vous qu’un PAM de NGG est situé immédiatement en aval de la séquence cible pour la reconnaissance Cas9. Pour former le complexe d’ARN gRNA, combinez l’ARN CRISPR et l’ARN traceur dans le tampon TE selon les directions manuscrites, pour une concentration finale en duplex de 44 micromolaires.
Incuber le mélange à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes et laisser refroidir à température ambiante. Diluer la nucléase recombinante Cas9 avec PBS pour une concentration finale de nucléase de 36 micromolaires. Mélangez ensuite un volume égal de la nucléase diluée avec chacun des duplex gRNA et incubez-les pendant 20 minutes à température ambiante pour permettre au complexe RNP de se former.
Centrifugeuse 2,5 millions de cellules dans un tube de 1,5 millilitre à 500 fois g pendant cinq minutes. Puis jeter le supernatant et re-suspendre les cellules dans 163 microlitres de RPMI 1640 moyen sans rouge phénol. Ajouter 16,7 microlitres du complexe RNP et 3,6 microlitres de 100 enhancer d’électroporation micromolaire dans les cellules et transférer le mélange dans une cuvette d’électroporation de 0,2 centimètre d’écart, en prenant soin de ne pas introduire de bulles.
Électroporer les cellules et les transférer dans un flacon de culture tissulaire T-25 contenant 6 millilitres de rpmi complet 1640 milieu. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Un jour après l’électroporation, diluer les cellules à 5000 cellules par millilitre dans le milieu complet RPMI 1640.
Et ajouter 100 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 96 puits. Culture des cellules pendant sept à 14 jours, puis extraire l’ADN génomique à l’aide d’un système de purification à haut débit. Ajouter 100 microlitres de fixation des plaques et de tampon de lyse à chaque puits d’une plaque d’extraction de 96 puits, suivie de 50 000 cellules re-suspendues dans 10 microlitres de PBS.
Mélanger le contenu du puits en faisant des tuyaux de haut en bas. Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre à l’ADN génomique de se lier aux puits. Ensuite, aspirez soigneusement la solution des puits et lavez-les avec 120 microlitres de tampon de lavage.
Séchez l’assiette à l’air libre. Ajoutez 20 microlitres de mélange PCR à chaque puits et exécutez pcr selon les instructions manuscrites. Une fois l’amplification terminée, estimer la quantité du produit en mesurant la concentration d’un certain nombre d’échantillons à l’intérieur d’un fluoromètre.
Diluer tous les échantillons à 0,5 nanogramme par microlitre avec de l’eau sans nucléase. Mélangez un microlitre du produit PCR dilué avec 8,5 microlitres de formamide déionisé et 0,5 microlitres de taille fluorescente étiquetée colorant standard dans un plat de 96 puits compatible avec l’analyseur génétique. Couvrir la plaque d’une plaque septa et dénoaturer les échantillons à 95 degrés Celsius pendant trois minutes dans un thermocycler.
Effectuez l’électrophoresis capillaire pour séparer les produits PCR étiquetés et analyser les résultats sur le logiciel d’analyse. Vérifiez l’icône orange pour afficher les fragments étiquetés et la norme de taille pour évaluer la qualité de l’appel de taille. Ensuite, vérifiez l’icône bleue pour afficher les produits PCR étiquetés.
Identifiez les pics correspondant aux produits de type sauvage et mutant et estimez le niveau de mutant dans chaque échantillon en divisant la zone sous le pic mutant par la somme de la zone sous les pics sauvages et mutants. Sélectionnez plusieurs pools cellulaires avec des niveaux élevés des suppressions attendues pour d’autres dilutions en série. Répétez l’extraction de l’ADN, pcr fluorescent, et les étapes d’électrophoresis capillaire et sélectionnez des clones avec des niveaux mutants supérieurs à 95% pour l’analyse ultérieure.
Extraire l’ARN total des clones sélectionnés et effectuer une synthèse gratuite de l’ADN. Mélanger l’ARN avec une amorce en poly-T et des dNTP selon les directives manuscrites et incuber à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, placez la réaction sur la glace pendant au moins une minute.
Ajouter dix microlitres de mélange de synthèse cDNA à la réaction. Puis incuber l’échantillon à 50 degrés Celsius pendant 50 minutes et 85 degrés Celsius pendant cinq minutes dans un thermocyclre. Après la synthèse de l’ADNC, traiter les échantillons avec un microlitre de RNase H et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Concevoir des amorces et des sondes TaqMan spécifiquement pour la variance de transcription individuelle générée par d’autres promoteurs et cloner les fragments d’ADN contenant les séquences de transcription spécifiques dans l’ADN plasmide. Faites une série décuplée de dilution des plasmides recombinants comme courbes standard pour la quantification de transcription. Préparez 20 microlitres de mix PCR pour chaque échantillon et exécutez le PCR en temps réel selon les instructions manuscrites.
Analyser les résultats et normaliser le numéro de copie des transcriptions cibles de chaque échantillon à l’moyen d’un gène d’entretien ménager. Ce protocole a été utilisé avec succès pour supprimer le silencieux intronique RUNX1 et la suppression a été confirmée par électrophoresis gel capillaire. Les tailles prévues des produits PCR sauvages et mutants sont d’environ 500 paires de base et 230 paires de base respectivement.
La taille des produits mutants peut varier d’un clone à l’autre en raison des indélébiles formées sur les sites de clivage. Le séquençage sanger a été utilisé pour confirmer l’identité des suppressions. Le gène RUNX1 contient deux promoteurs, P1 et P2, qui ont produit trois transcriptions majeures de l’ARNm : RUNX1c par P1, et RUNX1a et RUNX1b par P2. Le PCR quantitatif en temps réel peut être utilisé pour déterminer comment la suppression de l’élément silencieux affecte l’expression de ces transcriptions.
Une bonne conception des ARN CRISPR est importante pour son évaluation de l’expérience. Assurez-vous que l’ARN CRSIPR est emballé étroitement à la région de suppression prévue. Assurez-vous également qu’une séquence PAM est située en aval de la séquence cible pour la reconnaissance Cas9.
En plus d’étudier les CRA, cette stratégie peut être utilisée pour des études de localisation génétique et sert d’alternative à l’interférence arn pour examiner les fonctions génétiques. En combinant avec les techniques de capture de conformation chromosomique CRISPR aidera certainement à déchiffrer les participations des CR dans l’organisation altérée du génome et l’expression des gènes liés à divers problèmes de santé comme le cancer.
