Le protocole décrit ici nous permet d’étudier la fonction d’une chimiokine et le comportement du macrophage in vivo. La plupart des modèles expérimentaux existants de chimiotaxis cellulaires sont basés sur des expériences de cellules in vitro. Mais les expériences in vitro sont parfois trop simples pour modéliser l’environnement complexe in vivo.
En outre, ils peuvent ne pas représenter la capacité de chimioattraction in vivo. Ces méthodes utilisent l’avantage spécifique des poissons zèbres pour l’observation directe du comportement cellulaire, ce qui est difficile pour les souris. Commencez par générer des constructions transgéniques TGFABP-10A interleukin-34.
Injectez les constructions FABP-10A interleukin-34 en un seul stade cellulaire Tg (mpeg1:GFP) transgénique et un embryon de poisson de type sauvage avec la transposase MRNA. Élever et recueillir les embryons selon les instructions manuscrites. Ensuite, fixez-les avec 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit à 4 degrés Celsius ou pendant deux heures à température ambiante.
Après fixation, laver les embryons avec PBST trois fois pendant cinq minutes par lavage. Déshydratez les embryons séparément avec 50% de méthanol en PBST, suivi de 100% de méthanol, puis changez en méthanol frais à 100%, et stockez-les à 20 degrés Celsius négatifs pendant au moins 2 heures. Lorsqu’ils sont prêts pour l’hybridation de la sonde, réhydrater les embryons séparément dans 50% de méthanol dans PBST.
Ensuite, lavez-les avec PBST trois fois pendant cinq minutes par lavage. Digérer les embryons avec la proteinase K dans PBST à température ambiante. Ensuite, jetez la solution de digestion, et répétez la fixation avec 4% de paraformaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante.
Après la fixation, laver les embryons deux fois avec le PBST pendant 10 minutes par lavage. Effectuez la préhybridisation avec tampon d’hybridation chauffé à 65 degrés Celsius pendant au moins une heure. Ensuite, préchauffer la sonde interleukine-34 à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Recyclez le tampon d’hybridation dans le tube d’origine et effectuez l’hybridation avec la sonde préchauffée à 65 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, laver les embryons avec 50% de formamide et 2X SSCT suivi de 2X SSCT, puis 0,2X SSCT à 65 degrés Celsius. Répéter chaque lavage trois fois avec 20 minutes par lavage.
Ensuite, lavez les embryons trois fois avec le PBST pendant cinq minutes par lavage. Bloquez les échantillons avec 600 millilitres de tampon bloquant pendant une heure à température ambiante. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de solution anticorps anti-digoxigenin HRP et incubez les embryons à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, retirer l’anticorps et laver les embryons six fois avec le PBST pendant 20 minutes par lavage. Après le dernier lavage, rincer chaque échantillon avec 30 microlitres de 1X plus diluant d’amplification pendant cinq minutes. Incuber les échantillons dans la solution de travail de la tyramine fluorophore pendant cinq à 15 minutes dans l’obscurité.
Prolonger le temps d’incubation à 30 minutes si les signaux sont faibles. Ensuite, lavez les embryons avec PBST trois fois pendant 10 minutes par lavage. Et les incuber avec l’anticorps primaire à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, lavez les embryons cinq fois avec le PBST pendant 30 minutes par lavage, et incubez-les avec les anticorps secondaires à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lavez les embryons trois fois en PBST pendant 10 minutes par lavage, et conservez-les dans 70% de glycérol dans l’obscurité à quatre degrés Celsius ou négatifs 20 degrés Celsius plus longtemps. Avant l’imagerie, utilisez un microscope à fluorescence pour sélectionner les embryons rouges DS et GFP double positifs.
Pour monter le poisson, utilisez un bain en métal pour chauffer un millilitre de 1% de faible fondant agarose à plus de 90 degrés Celsius. Ensuite, refroidissez-le à la température corporelle et mélangez-le en 50 microlitres de 0,2% de tricaine. Transférer les embryons anesthésiés dans un petit plat monté avec une toboggan sur le fond.
Enlevez l’eau environnante et déposez lentement la faible fonte sur les embryons. Réglez soigneusement la position du poisson avant que l’agarose ne se soit solidifiée, en gardant la zone hépatique près de la glissière de couverture. Une fois que l’agarose s’est solidifiée, couvrez-la soigneusement d’une autre couche d’agarose pour la renforcer.
Placez le plat sur la table confocale du porte-microscope, couvrez le poisson de la solution E2 avec de la tricaine et commencez l’imagerie. Pour faire fonctionner le microscope confocal, ouvrez le logiciel Zen Black 2.3 et cliquez sur localiser, puis l’incubation, puis réglez la température à 29 degrés Celsius. Cliquez sur le menu d’acquisition et sélectionnez le mode de numérisation et les lasers requis dans le menu d’installation intelligent.
Sélectionnez ensuite Z-stack et position. Cliquez sur le menu du concepteur expérimental et sélectionnez activer l’expérience multibloc dans le premier bloc pour trouver l’échantillon sous faible grossissement. Ensuite, passez au grossissement élevé et laissez la zone observée au centre du champ visuel.
Définissez la position et les informations Z-stack. Sélectionnez ensuite l’intensité laser appropriée, les couches de balayage et la vitesse d’imagerie. Une fois que tous les blocs sont configurés, définissez le nombre approprié de boucles et commencez à enregistrer.
Ce protocole a été employé pour injecter un interleukin-34 foie-spécifique au-dessus du plasmide d’expression dans les embryons transgéniques de poissons, qui les macrophages de s ont été étiquetés avec GFP. L’hybridation et l’immunostaining in situ de fluorescence de montage complet ont été employés pour analyser l’expression de l’interleukin-34 et des macrophages étiquetés de GFP. Les nombres de cellules de macrophage ont été quantitativement analysés dans la région non injectée et construisent le foie et la queue des embryons injectés.
L’imagerie vivante a été utilisée pour observer directement les macrophages, étiquetés verts, en passant par le foie d’un poisson de contrôle et en migrant dans le foie d’un interleukine-34 sur l’expression des poissons. Les étapes importantes de ce protocole comprennent le choix d’une ligne transgénique appropriée pour étiqueter la cellule d’intérêt. Et des tissus appropriés pour l’imagerie de votre expression du gène transgénique ainsi que d’une fenêtre de temps d’observation appropriée.
Cette technique pourrait être appliquée pour étudier la fonction d’autres chimiokines sur le comportement d’autres cellules, telles que les T-cells et les neutrophiles in vivo.
