Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es uns, die Funktion eines Chemokins und das Verhalten von Makrophagen in vivo zu untersuchen. Die meisten bestehenden experimentellen Modelle von Zellchemotaxis basieren auf In-vitro-Zellexperimenten. Aber In-vitro-Experimente sind manchmal zu einfach, um die komplexe Umgebung in vivo zu modellieren.
Außerdem stellen sie möglicherweise nicht die Chemoanziehungsfähigkeit in vivo dar. Diese Methoden nutzen den spezifischen Vorteil von Zebrafischen für die direkte Zellverhaltensbeobachtung, was für Mäuse schwierig ist. Beginnen Sie mit der Erzeugung von transgenen KONSTRUKTen TGFABP-10A interleukin-34.
Injizieren Sie die FABP-10A Interleukin-34-Konstrukte in eine Zellstufe Tg(mpeg1:GFP)transgenic und eine wildartige Fischembryonen zusammen mit der Transposase MRNA. Heben und sammeln Sie die Embryonen nach Manuskriptanweisungen. Dann fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 Grad Celsius oder für zwei Stunden bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die Embryonen nach der Fixierung dreimal fünf Minuten pro Wäsche mit PBST. Dehydrieren Sie die Embryonen separat mit 50% Methanol in PBST, gefolgt von 100%methanol, dann wechseln Sie zu frischem 100%methanol, und lagern Sie sie bei negativen 20 Grad Celsius für mindestens 2 Stunden. Wenn Sie für die Sondenhybridisierung bereit sind, rehydrieren Sie die Embryonen separat in 50% Methanol in PBST.
Dann waschen Sie sie mit PBST dreimal für fünf Minuten pro Wäsche. Verdauen Sie die Embryonen mit Proteinase K in PBST bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie dann die Verdauungslösung und wiederholen Sie die Fixierung mit 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die Embryonen nach der Fixierung zweimal mit PBST für 10 Minuten pro Wäsche. Führen Sie eine Vorhybridisierung mit einem erhitzten Hybridisierungspuffer bei 65 Grad Celsius für mindestens eine Stunde durch. Dann die Interleukin-34 Sonde 10 Minuten auf 65 Grad Celsius vorheizen.
Recyceln Sie den Hybridisierungspuffer in das Originalrohr und führen Sie die Hybridisierung mit der vorgeheizten Sonde bei 65 Grad Celsius über Nacht durch. Am nächsten Tag die Embryonen mit 50% Formamid und 2X SSCT, gefolgt von 2X SSCT und dann 0,2X SSCT bei 65 Grad Celsius waschen. Wiederholen Sie jede Wäsche dreimal mit 20 Minuten pro Wäsche.
Dann waschen Sie die Embryonen dreimal mit PBST für fünf Minuten pro Wäsche. Blockieren Sie die Proben mit 600 MilliliterBlockiden für eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann 400 Mikroliter Anti-Digoxigenin HRP-Antikörperlösung hinzufügen und die Embryonen bei vier Grad Celsius über Nacht inkubieren.
Am nächsten Tag den Antikörper entfernen und die Embryonen sechsmal mit PBST für 20 Minuten pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche jede Probe mit 30 Mikrolitern 1X plus Amplifikationsverdünnung für fünf Minuten abspülen. Inkubieren Sie die Proben in der Fluorophor-Tyramin-Arbeitslösung für fünf bis 15 Minuten im Dunkeln.
Verlängerung der Inkubationszeit auf 30 Minuten, wenn die Signale schwach sind. Dann waschen Sie die Embryonen mit PBST dreimal für 10 Minuten pro Wäsche. Und bebrüten sie mit dem primären Antikörper bei vier Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Tag die Embryonen fünfmal mit PBST für 30 Minuten pro Wäsche waschen und mit den sekundären Antikörpern bei vier Grad Celsius über Nacht bebrüten. Am nächsten Tag die Embryonen dreimal in PBST für 10 Minuten pro Wäsche waschen und länger in 70% Glycerin im Dunkeln bei vier Grad Celsius oder minus 20 Grad Celsius lagern. Wählen Sie vor der Bildgebung ein Fluoreszenzmikroskop aus, um die doppelten positiven DS- und GFP-Embryonen auszuwählen.
Um die Fische zu montieren, verwenden Sie ein Metallbad, um einen Milliliter 1%niedriger Schmelzagarose auf über 90 Grad Celsius zu erhitzen. Dann kühlen Sie es auf Körpertemperatur und mischen Sie in 50 Mikroliter 0,2%Tricaine. Übertragen Sie die anästhesierten Embryonen auf eine kleine Schale, die mit einer Abdeckungsrutsche auf der Unterseite montiert ist.
Entfernen Sie das umgebende Wasser und lassen Sie langsam die niedrig schmelzende Agarose auf die Embryonen fallen. Stellen Sie die Position der Fische sorgfältig ein, bevor sich die Agarose verfestigt hat, sodass der Leberbereich in der Nähe des Deckschlittens gehalten wird. Sobald die Agarose verfestigt ist, bedecken Sie sie vorsichtig mit einer anderen Schicht Von Agarose, um sie zu verstärken.
Legen Sie die Schale auf den konfokalen Mikroskopträgertisch, bedecken Sie den Fisch mit der E2-Lösung mit Tricain und beginnen Sie mit der Bildgebung. Um das konfokale Mikroskop zu betreiben, öffnen Sie die Zen Black 2.3 Software und klicken Sie auf Locate, dann inkubieren und dann die Temperatur auf 29 Grad Celsius einstellen. Klicken Sie auf das Erfassungsmenü und wählen Sie den gewünschten Scanmodus und die Laser im Smart-Setup-Menü aus.
Wählen Sie dann Z-Stack und Position aus. Klicken Sie auf das experimentelle Designermenü und wählen Sie Multiblock-Experiment im ersten Block aktivieren, um die Probe unter geringer Vergrößerung zu finden. Wechseln Sie dann zur hohen Vergrößerung und lassen Sie den beobachteten Bereich in der Mitte des Gesichtsfeldes.
Legen Sie die Position und die Z-Stack-Informationen fest. Wählen Sie dann die entsprechende Laserintensität, Scan-Schichten und Bildgeschwindigkeit aus. Sobald alle Blöcke eingerichtet sind, legen Sie die entsprechende Anzahl von Schleifen fest und starten Sie die Aufnahme.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um ein leberspezifisches Interleukin-34 über Expressionplasmid in transgene Fischembryonen zu injizieren, deren Makrophagen mit GFP gekennzeichnet wurden. Zur Analyse der Expression von Interleukin-34 und der GFP-bezeichneten Makrophagen wurden die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und Immunfärbung mit voller Mount-Fluoreszenz und Immunfärbung verwendet. Makrophagenzellzahlen wurden quantitativ in nicht injiziert und konstruieren injizierte Embryos Leber und SchwanzRegion.
Live-Bildgebung wurde verwendet, um Makrophagen direkt zu beobachten, grün markiert, vorbei an der Leber eines Kontrollfisches und Wandern in die Leber eines Interleukin-34 über extierbaren Fisch. Zu den wichtigen Schritten dieses Protokolls gehört die Auswahl einer geeigneten transgenen Linie zur Kennzeichnung der Zelle von Interesse. Und geeignetes Gewebe für die Abbildung Ihrer Expression des transgenen Gens sowie ein geeignetes Beobachtungszeitfenster.
Diese Technik könnte angewendet werden, um die Funktion anderer Chemokine auf das Verhalten anderer Zellen, wie T-Zellen und Neutrophilen in vivo, zu untersuchen.
