O protocolo aqui descrito nos permite investigar a função de uma quimiocina e o comportamento do macrófago in vivo. A maioria dos modelos experimentais existentes de quimitaxis celulares são baseados em experimentos in vitro celulares. Mas experimentos in vitro às vezes são muito simples para modelar o ambiente complexo in vivo.
Além disso, eles podem não representar a capacidade de quimioterapia in vivo. Esses métodos utilizam a vantagem específica do peixe zebra para observação direta do comportamento celular, o que é difícil para os camundongos. Comece gerando construções transgênicas TGFABP-10A-34.
Injete os construções de interleucina FABP-10A-34 em um estágio celular Tg (mpeg1:GFP)transgênico e embriões de peixe silvestre junto com a transposase MRNA. Levante e colete os embriões de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, fixá-los com 4% de paraformaldeído durante a noite a 4 graus Celsius ou por duas horas em temperatura ambiente.
Após a fixação, lave os embriões com PBST três vezes por cinco minutos por lavagem. Desidratar os embriões separadamente com 50% de metanol no PBST, seguido de 100% de metanol, depois mudar para metanol fresco 100%, e armazená-los a 20 graus Celsius negativos por pelo menos 2 horas. Quando estiver pronto para hibridização da sonda, reidrate os embriões separadamente em 50% de metanol em PBST.
Em seguida, lave-os com PBST três vezes por cinco minutos por lavagem. Digerir os embriões com proteinase K em PBST à temperatura ambiente. Em seguida, descarte a solução de digestão e repita a fixação com 4% de paraformaldeído por 20 minutos à temperatura ambiente.
Após a fixação, lave os embriões duas vezes com PBST por 10 minutos por lavagem. Realize a pré-hibridização com tampão de hibridização aquecido a 65 graus Celsius por pelo menos uma hora. Em seguida, pré-aqueça a sonda interleucina-34 a 65 graus Celsius por 10 minutos.
Recicle o tampão de hibridização no tubo original e realize a hibridização com a sonda pré-aquecido a 65 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave os embriões com 50% de formamida e 2X SSCT seguidos por 2X SSCT e depois 0,2X SSCT a 65 graus Celsius. Repita cada lavagem três vezes com 20 minutos por lavagem.
Em seguida, lave os embriões três vezes com PBST por cinco minutos por lavagem. Bloqueie as amostras com 600 mililitros de tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 400 microliters de solução de anticorpos HRP anti-digoxigenina e incuba os embriões a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, remova o anticorpo e lave os embriões seis vezes com PBST por 20 minutos por lavagem. Após a última lavagem, enxágue cada amostra com 30 microlitres de 1X mais diluente de amplificação por cinco minutos. Incubar as amostras na solução de trabalho de tiramina fluoroforina por cinco a 15 minutos no escuro.
Estendendo o tempo de incubação para 30 minutos se os sinais estiverem fracos. Em seguida, lave os embriões com PBST três vezes por 10 minutos por lavagem. E incuba-los com o anticorpo primário a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, lave os embriões cinco vezes com PBST por 30 minutos por lavagem, e incuba-os com os anticorpos secundários a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave os embriões três vezes em PBST por 10 minutos por lavagem, e armazene-os em 70% de glicerol no escuro a quatro graus Celsius ou 20 graus Celsius negativos por mais tempo. Antes da imagem, use um microscópio de fluorescência para selecionar os embriões vermelhos DS e GFP duplo positivo.
Para montar o peixe, use um banho de metal para aquecer um mililitro de 1% de baixa agarose de fusão a acima de 90 graus Celsius. Em seguida, esfrie-o à temperatura corporal e misture em 50 microliters de 0,2% tricaine. Transfira os embriões anestesiados para um pequeno prato montado com um slide de cobertura na parte inferior.
Remova a água circundante e lentamente deixe cair a baixa agarose de derretimento sobre os embriões. Ajuste cuidadosamente a posição do peixe antes que a agarose se solidifique, mantendo a área do fígado perto do deslizamento de cobertura. Uma vez que a agarose tenha solidificado, cubra-o cuidadosamente com outra camada de agarose para reforçá-la.
Coloque o prato na mesa portadora do microscópio confocal, cubra o peixe com a solução E2 com tricaine e inicie a imagem. Para operar o microscópio confocal, abra o software Zen Black 2.3 e clique em localizar, em seguida, incubação e, em seguida, definir a temperatura para 29 graus Celsius. Clique no menu de aquisição e selecione o modo de varredura e lasers necessários no menu de configuração inteligente.
Em seguida, selecione pilha-Z e posição. Clique no menu de designer experimental e selecione ativar o experimento multi-bloco no primeiro bloco para encontrar a amostra sob baixa ampliação. Em seguida, mude para a alta ampliação e deixe a área observada no centro do campo visual.
Defina as informações de posição e z-stack. Em seguida, selecione a intensidade do laser apropriada, camadas de varredura e velocidade de imagem. Uma vez que todos os blocos estejam configurados, defina o número apropriado de loops e comece a gravar.
Este protocolo foi usado para injetar uma interleucina específica do fígado-34 sobre a expressão plasmid em embriões de peixes transgênicos, que os macrófagos foram rotulados com GFP. Fluorescência de montagem total na hibridização situ e imunostaining foram utilizados para analisar a expressão de macrofagos rotulados interleucina-34 e GFP. Os números de células macrófagos foram analisados quantitativamente em uma região de fígado e cauda injetadas.
Imagens vivas foram utilizadas para observar diretamente macrófagos, rotulados de verde, passando pelo fígado de um peixe de controle e migrando para o fígado de uma interleucina-34 sobre a expressão de peixes. As etapas importantes deste protocolo incluem a seleção de uma linha transgênica adequada para rotular a célula de interesse. E tecido apropriado para a imagem de sua expressão de gene transgênico, bem como uma janela de tempo de observação apropriada.
Essa técnica poderia ser aplicada para estudar a função de outras quimiocinas no comportamento de outras células, como células T e neutrófilos in vivo.
