Cette méthode sera utile pour les études biologiques de base liées à l’interaction entre le microbiote intestinal et la santé intestinale. En outre, ce protocole peut être utilisé pour le dépistage des probiotiques potentiels et nutraceutiques pour guérir les problèmes de santé intestinale, tels que le syndrome intestinal qui fuit et les maladies inflammatoires de l’intestin. Ce protocole utilise un système d’imagerie à haut débit pour permettre une analyse quantitative rapide et précise de la perméabilité intestinale chez C.elegans traité avec diverses bactéries et produits chimiques.
Nous recommandons qu’un scientifique qui n’est pas familier avec cette technique limite le nombre d’échantillons afin d’éviter les erreurs d’beling et d’autres erreurs. Cette procédure se compose de nombreuses étapes qui nécessitent une démonstration visuelle, comme le transfert de vers à des plaques de 96 puits et l’utilisation de la machine Operetta, ainsi que le logiciel Harmony. Commencez par préparer 500 millilitres de LB stérile moyen.
Inoculer une seule colonie de P.aeruginosa dans le milieu, et incuber la culture pendant 14 à 15 heures à 37 degrés Celsius tout en secouant à 150 rpm. Le lendemain, répartir uniformément la culture bactérienne en deux tubes de 500 millilitres et les centrifuger à 3 220 fois g et quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Retirer le supernatant, en laissant 25 millilitres dans chaque tube, pour un volume total restant de 50 millilitres, puis résuspendez la pastille bactérienne.
Conserver la culture bactérienne à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Pour tester les effets des bactéries sur la perméabilité intestinale de C.elegans, retirez les cultures du réfrigérateur et vortexez-les complètement. Ajouter un total de 800 microlitres à chaque plaque de NGM fraîche et laisser sécher les plaques dans un incubateur de 20 degrés Celsius pendant la nuit.
Pour préparer les assiettes DIM, ajouter 50 millilitres d’agar NGM moyen dans une bouteille de DIM contenant du bouillon NGM, et bien mélanger. Verser ensuite 20 millilitres de milieu dans chaque boîte de Pétri de 90 x 15 millimètres. Préparer les assiettes DMSO en ajoutant 20 millilitres de DMSO contenant du NGM moyen à chaque boîte de Pétri, et laisser les assiettes à température ambiante pendant au moins trois heures pour se solidifier.
Étendre 800 microlitres d’E.coli vortex ou de culture P.aeruginosa sur chaque plaque NGM fraîche, et laisser sécher les plaques dans un incubateur de 20 degrés Celsius pendant la nuit. Lavez les larves L4 synchronisées par âge avec le tampon S et transférez environ 500 vers dans les plaques NGM contenant différentes bactéries et produits chimiques. Puis, incuber les plaques à 20 degrés Celsius pendant 48 heures.
Préparer les plaques complétées par fitc-dextran en mélangeant deux millilitres d’E.coli inactivé par la chaleur avec quatre milligrammes de FITC-dextran. Ajouter 100 microlitres du mélange à chacune des 20 assiettes fraîches d’agar NGM et laisser sécher les assiettes pendant une heure sur un banc de laboratoire propre. Après 48 heures de traitement, lavez les vers avec du tampon S, transférez-les dans des assiettes complétées par fitc-dextran et dans des plaques NGM sans FITC-dextran, et incubez les plaques pendant la nuit.
Le lendemain, lavez les vers avec du tampon S et laissez-les ramper dans la plaque d’agar NGM fraîche pendant une heure. Ajouter 50 microlitres de formaldéhyde de 4 % à chaque puits d’une plaque noire à fond plat de 96 puits et transférer environ 50 vers dans chaque puits. Après une à deux minutes, retirer tout le formaldéhyde et ajouter 100 microlitres de milieu de montage dans chaque puits.
Le formaldéhyde est un produit chimique toxique et doit être manipulé avec soin. Pour capturer des images fluorescentes, appuyez sur l’icône Open Lid dans le logiciel d’imagerie et insérez la plaque dans la machine. Cliquez sur Configuration, sélectionnez le type de plaque et ajoutez les canaux brightfield et EGFP.
Pour ajuster la mise en page, passez à la sélection Mise en page et sélectionnez Piste. Réglez la première image à un micromètre, le nombre d’avions à 10, et la distance à un micromètre. Sélectionnez l’un des puits de traitement et un champ de capture, et appuyez sur Test dans la section Exécuter l’expérience.
Si les images sont satisfaisantes, retournez à la section Configuration et appuyez sur l’icône Réinitialisation. Ensuite, sélectionnez tous les puits cibles et un nombre approprié de champs de capture. Allez exécuter l’expérience, entrez le nom de la plaque et appuyez sur Démarrer.
Pour mesurer l’intensité de fluorescence, rendez-vous à la section Analyse d’image, entrez l’image et trouvez la cellule en choisissant le canal EGFP et la méthode B.Ajustez les paramètres en fonction des instructions manuscrites, et choisissez la moyenne comme sortie. Appuyez sur l’icône Appliquer pour enregistrer la configuration. Obtenez une carte thermique et une table de données en vous rendre à la section Évaluation et ajustez le paramètre de lecture, puis commencez l’évaluation.
C.elegans a montré une augmentation significative de la fluorescence fitc-dextran après incubation avec P.aeruginosa comparé aux deux autres souches bactériennes, indiquant que P.aeruginosa a causé des dommages plus vitaux à la barrière épithéliale d’intestin et à la perméabilité intestinale accrue. P.aeruginosa vivant et inactivé par la chaleur a déclenché des effets très différents sur la perméabilité intestinale chez C.elegans. Lors de l’inactivation thermique, les images de fluorescence et les données statistiques indiquent que P.aeruginosa n’a pas déclenché de toxicité pour les nématodes.
Un co-traitement de 48 heures avec DIM a diminué de manière significative l’intensité de fluorescence fitc-dextran à l’intérieur des intestins des vers exposés à P.aeruginosa, ce qui démontre que dim peut être considéré comme un bon produit naturel pour guérir le dysfonctionnement de perméabilité intestinale causée par des infections bactériennes. Il est important de se rappeler que lors de la préparation des plaques enduites de FITC-dextran, vous devez minimiser l’exposition à la lumière en raison de la sensibilité à la lumière du FITC-dextran. Cette technique peut être utilisée pour déterminer les effets pathogènes et probiotiques des bactéries intestinales et de leurs composants actifs en testant les bactéries, ainsi que leur composition chimique.
