L’objectif central pour le développement de la technique csBN-MS était d’obtenir un accès complet à l’organisation et à l’assemblage de complexes protéiques qui sous-tendent la transduction du signal à la membrane plasmatique de divers types de tissus et d’organes. csBN-MS offre actuellement la plus grande polyvalence de résolution pour l’analyse du complexe protéique indigène et de leur composition sous-unit, en particulier en ce qui concerne les protéines membranaires. Bien que la technique csBN-MS ait été développée pour analyser des mélanges complexes d’assemblages de protéines membranaires dans le cerveau des rongeurs, elle peut facilement être adaptée à l’analyse de tout type d’échantillon biologique.
Une des étapes clés de notre méthode est l’intégration de la pièce de gel et son alignement correct sur le plan de coupe avant de trancher. Veillez à ne pas déchirer ou compresser le gel et assurez-vous qu’il n’est pas incliné vers le plan de coupe car cela réduirait la résolution de l’analyse. Notre technique csBN-MS a plusieurs étapes pratiques qui sont cruciales pour de bons résultats.
Il est plus facile de montrer comment effectuer ces étapes en détail qu’en les décrivant simplement. Pour commencer cette procédure, utilisez un mélangeur de gradient de deux chambres en remuant entraîné par une pompe pour lancer un gel de gradient de pore linéaire ou hyperbolique. Préparer des solutions pour la chambre de mélange avant et la chambre de réservoir telles qu’décrites dans le protocole de texte.
Démarrez l’agitateur et ajoutez 30 microlitres d’APS et 2,5 microlitres de TEMED à la solution dans la chambre avant. Ensuite, démarrez la pompe et ouvrez la vanne avant. Après environ une minute, ajouter 90 microlitres d’APS et cinq microlitres de TEMED à la chambre du réservoir et ouvrir la connexion de la chambre.
Laissez le gel polymériser lentement et soigneusement pendant au moins 24 heures à température ambiante pour générer un gradient homogène de taille des pores. S’il est conservé humide, le gel polymérisé peut être conservé à la verticale à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Ensuite, préparez les fentes de chargement en insérant les espaces appropriés entre les plaques de verre pour séparer entre 0,5 et 2,0 milligrammes de protéines.
Les fentes doivent avoir au moins trois centimètres de large. Pour les tampons en cours d’exécution, préparez un tampon cathodique permanent composé de tricine de 50 millimolaires, de 50 millimolaires Bis-Tris et de 0,01 % de Coomassie G-250. Préparez un tampon anode standard composé de 50 millimolaires Bis-Tris.
Solubiliser environ 2,5 milligrammes de membrane et deux millilitres de tampon de solubilisation contenant 1 % de détergent non dénaturant sur la glace pendant 30 minutes. Puis ultracentrifugeuse à 130 000 fois G pendant 11 minutes. Concentrez le solubilisate sur un court gradient d’étape de saccharose de 50%20% par ultracentrifugation à 400 000 fois G pendant une heure.
Après cela, récolter le gradient de saccharose à partir du fond du tube, ajouter 0,05%Coomassie G-250 au solubilisate, et charger l’échantillon sur le gel. Exécutez une BN-PAGE préparative à 10 degrés Celsius pendant la nuit à l’aide d’un protocole de tension en trois étapes, tel que décrit dans le protocole de texte. Après que le gel a exécuté numériser les gels à des fins de documentation tout en le gardant entre les plaques de verre.
Inspecter la qualité de la séparation du gel. Ensuite, diffusez les plaques et excisez les sections de voie d’intérêt. Fixer les voies deux fois avec 30 % d’éthanol et 15 % d’acide acétique pendant au moins 30 minutes.
Transférer l’échantillon de milieu d’intégration et lui permettre de tremper et d’équilibrer pendant au moins deux heures tout en gardant la dalle de gel au ralenti sur un shaker orbital. Ensuite, coupez les voies de gel fixe en sections exactement parallèles au front de migration des protéines, ou modèle de bande. Placez chaque section sur un support de film plastique avec des dimensions égales pour une manipulation plus facile.
Transférer les voies dans un tube ouvert avec des bouchons qui sont fermés sur le fond et centralement perforés sur le dessus, à la fois précisément alignés avec les extrémités supérieure et inférieure de la section gel. Trempez brièvement le cylindre dans l’azote liquide pour initier rapidement la solidification. Le milieu d’intégration transparent se solidifie en quelques secondes et devient blanc en couleur.
Remplissez la cavité d’un milieu d’intégration, trempez brièvement le cylindre dans de l’azote liquide, puis laissez-le geler complètement à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs heures. Après le démontage, retirer le film plastique et transférer le bloc avec la section de gel intégré à un cylindre en métal refroidi. Le cylindre est de plus grand diamètre et scellé à l’extérieur avec un milieu d’intégration.
Il est placé sur un support plat. Remplissez le cylindre d’un milieu d’intégration et congelez soigneusement comme mentionné précédemment. Répétez cette procédure de l’autre côté du cylindre pour obtenir un bloc solide avec une surface inférieure coplanaire.
Ensuite, retirez le bloc du cylindre et utilisez le milieu d’intégration pour le coller à un support métallique pré-refroidi. Insérez le support métallique dans la machine à cryoslicing. Le support doit être soigneusement aligné par rapport au plan de tranchage.
Laissez le bloc s’équilibrer à la température optimale pour le processus de tranchage. Après cette récolte, le gel tranche les uns après les autres avec une épaisseur finale désirée de 0,25 millimètre de taille d’étape et les transférer individuellement dans des tubes de réaction avec de faibles propriétés de liaison protéique. Ensuite, les tranches sont soumises à la digestion tryptique et à l’analyse spectrométrique de masse.
Ce protocole étend l’application du profilage complexome à haute résolution aux membranes non mitochondriques exprimant des protéines faiblement abondantes. La séparation complexe montre des bandes protéiques fortement tachées avec très peu d’artefacts de migration. Les écarts de signaux peptidiques dans la masse et le temps de rétention indiquent un taux très faible pour l’affectation de volume de pointe faussement positive.
Les variations run-to-run sont facilement éliminées en recalcalant les ensembles de données de volume de pointe. L’information sur l’intensité peptidique qui en résulte est ensuite utilisée pour reconstruire 2545 profils protéiques d’abondance relative. La pertinence de l’échantillonnage du gel pour la résolution des complexes protéiques a été évaluée en joignant des ensembles de données de tranches adjacentes.
À 0,25 millimètre, la séparation de la taille des populations complexes associées à PTC1 est bien en accord avec les résultats de l’analyse des taches occidentales. L’assemblage de plus de deux tranches abolit la discrimination à l’égard des sous-populations complexes de PTC1. Enfin, l’analyse fournit des informations sur des complexes bien caractérisés et démontre l’existence de nouvelles sous-unités et d’assemblages complexes.
Pour la ferritine, les profils de sous-unité ajustés en fonction de leur abondance relative suggèrent l’existence d’au moins trois isoformes complexes avec des stoichiomètres distincts à chaîne lourde/légère. En revanche, les complexes de nicalin-nomo1, le complexe de noyau gamma-sécréase, et les machines de GPI-transamidase montrent des rapports fixes d’abondance de leurs sous-unités de noyau sur la gamme entière de taille et indépendamment de l’association avec des protéines additionnelles. Le paramètre clé de l’analyse csBN-MS est la résolution efficace des complexes, qui est déterminée par la biochimie de l’échantillon, la qualité du gel BN, un alignement approprié lors de l’intégration et du tranchage, et la qualité des données de SP acquises.
Le peignage du csBN-MS avec l’étiquetage isotopique des protéines et des échantillons permettra de comparer directement les complexomes à différents états pathophysiologiques, biologiques ou développementaux. CsBN-MS effectué sur les membranes du cerveau des rongeurs a révélé l’énorme diversité des récepteurs, des canaux iion, et les transporteurs en ce qui concerne leur composition sous-unité et leur fonction, et il sera instrumental pour analyser la structure 3D dans les préparations indigènes.
