Nous avons développé une nouvelle méthode pour enregistrer le signal neuronal extracellulaire à partir du cerveau des poissons nageant librement. Cela ouvre la porte à l’étude des mécanismes neuronaux à la fin de la journée le comportement des poissons. Cette méthode est valide et étanche et permet donc l’enregistrement pendant que les poissons nagent librement dans le réservoir d’eau.
En outre, l’emplacement d’enregistrement peut être contrôlé par le lecteur micro intégré. Tal Zoor-Novoplansky, notre technicien de laboratoire, m’aidera à démontrer cette procédure. Pour construire le boîtier, utilisez une plaque en laiton avec des dimensions de 19 millimètres par 29 millimètres par millimètres par millimètre.
Avec deux fentes de 5,5 millimètres sur les côtés longs, perpendiculairement au bord. Les fentes doivent être à 6,5 millimètres du côté étroit. À l’aide de pinces, plier la zone entre les fentes sur les longs côtés vers l’intérieur.
Pliez ensuite la partie inférieure vers l’intérieur et le côté supérieur vers l’extérieur pour obtenir le logement. Ensuite, utilisez un morceau d’aneth de trois millimètres pour faire des trous dans le boîtier micro drive pour les vis et souder les côtés du boîtier. Utilisez un fichier circulaire fin pour créer une petite fente semi-circulaire au bas du boîtier qui a un rayon de 1,5 millimètre.
À l’aide d’un foret d’un millimètre, faire un trou à l’arrière du boîtier pour les tétrodes. Tout d’abord, utilisez un coupeur pour détacher un morceau de trois broches à partir d’une bande d’en-tête mâle à simple rangée. À l’aide de pinces sortir la goupille du milieu.
Ensuite, utilisez un coupeur pour couper les broches restantes à 10 millimètres de longueur. Utilisez un foret numéro 65 pour percer un trou à travers le trou de goupille du milieu et utilisez un double zéro 99 robinet pour percer un fil. Assembler le micro entraînement et les plaques de laiton.
Insérez une vis à travers la première plaque de laiton, à travers le fil d’en-tête de broche, puis à travers la deuxième plaque de laiton. Enfin, placez un écrou sur la vis et serrez doucement le micro disque assemblé. Souder les broches avec les plaques de laiton et souder l’écrou avec le bout de la vis.
Après cela, soudeur le lecteur micro dans le boîtier micro drive à quatre points sur les côtés des plaques de cuivre micro lecteur. À l’aide de colle époxy, un tube en acier inoxydable de six millimètres de long à la petite fente semi-circulaire au bas du boîtier du micro entraînement. Collez un tube en acier inoxydable de trois millimètres de long à la tête de broche de sorte qu’il soit aligné avec le tube de six millimètres de long sur le boîtier.
Insérez les tubes de silicone et de polyimide préparés dans les deux tubes en acier inoxydable et utilisez de la colle cyanoacrylate pour les coller au tube de vol inoxydable fixé à l’en-tête de broche. Ensuite, vissez le lecteur micro tout le chemin vers le haut et couper l’excès de tuyaux à partir du haut et le bas des deux tubes en acier. Ensuite, coupez deux fils d’argent nu d’un diamètre de 75 micromètres sur une longueur de 12 centimètres et soudez-les à la fois à la connexion au sol dans le tableau d’interface électrode et à tous les canaux inutilisés.
Poussez l’un des fils de tungstène préparés dans l’un des trous d’un tableau d’interface d’électrode de 16 canaux. Placez une épingle dans le trou et appuyez dessus avec une paire de pinces. Mesurez la résistance entre la goupille et le côté non codé du fil pour vérifier la connectivité.
Répétez ce processus pour tous les fils préparés, y compris un fil de 50 micromètres pour l’électrode de référence. Ensuite, regroupez les fils d’électrode en deux groupes de quatre fils chacun et collez-les ensemble à l’aide de ruban adhésif à l’extrémité de chaque fil laissant le fil de référence seul. Maintenez le tableau d’interface de l’électrode au-dessus d’un dispositif de rotation motorisé et placez l’extrémité du ruban adhésif d’un groupe de quatre fils sur l’appareil.
Appliquer 130 tours dans le sens des aiguilles d’une montre suivis de 20 rotations dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Ensuite, appliquez de la colle cyanoacrylate pour couvrir la tétrode. Une fois la colle durcie, couper la tétrode près du ruban adhésif.
Répétez ce processus de rotation, de collage et de coupe à l’autre tétrode. Tout d’abord, fixez le boîtier micro drive à la logger avec deux vis millimétriques. Enfilez les tétrodes et l’électrode de référence à travers le trou à l’arrière du boîtier micro drive.
Enfiler les tétrodes à travers les deux tubes de silicone et enfiler le fil de tungstène de 50 micromètres à travers le tube de polyimide. Vissez la micro plongée tout le chemin vers le bas et appliquer de la colle cyanoacrylate sur le dessus des tubes pour coller les tétrodes et les fils à leurs tubes et de s’assurer que le mouvement est compatible avec le lecteur micro. Vissez le lecteur micro tout le chemin vers le haut.
Appliquez du pétrole souple sur les tétrode et les fils exposés à l’intérieur du boîtier du micro entraînement pour éviter le mouvement. Fixez une fenêtre inférieure de boîte de Pétri précoupée à l’avant du boîtier de lecteur micro avec l’époxy tout en s’assurant de garder les fils de sol à l’extérieur de la fenêtre. Ensuite, appliquez le revêtement vulcanisant à température ambiante sur les tétrodes et les fils exposés entre le couvercle de la boîte de bûcheron et le boîtier en micropropulsion.
Utilisez des ciseaux pointus pour couper les tétrodes et le fil de référence à la longueur désirée. Après cela attacher la marque, mousse de polystyrène exsudée à la boîte. Ajustez sa taille de façon à ce que sa flottabilité soit équilibrée lorsqu’elle est immergée dans le bain d’eau.
Après avoir anesthésié le poisson, sortez le poisson de l’eau et placez-le dans le support. Utilisez une spatule stérile pour appliquer une pâte de lidocaïne à cinq pour cent sur la peau au-dessus du site de chirurgie désigné pendant 10 minutes. Retirez ensuite la lidocaïne.
Utilisez un scalpel stérile à lame numéro 15 pour enlever la peau au-dessus du crâne dans la région désignée pour l’implant. Ensuite, utilisez une perceuse dentaire avec des foreuses de 0,7 millimètre pour percer quatre trous dans le crâne. Appliquez de la colle cyanoacrylate sur l’un des trous et insérez immédiatement une vis d’un millimètre.
Répétez ce processus pour les trous de forage restants. Après cela, utilisez un brûleur dentaire pour appliquer du ciment dentaire sur les vis et à la périphérie du crâne exposé. À l’aide de la perceuse dentaire faire un trou qui est de cinq millimètres de diamètre au-dessus de la région du cerveau d’intérêt.
Utilisez des pinces fines et du papier de soie molle pour enlever les tissus adipeux entre le crâne et le cerveau et exposer la cible de la région du cerveau en prenant soin de ne pas endommager les gros vaisseaux sanguins sous le crâne. Tout d’abord, abaissez l’implant de telle sorte que les électrodes sont insérées dans le cerveau tandis que la partie inférieure du boîtier micro drive est près du crâne. Commencez à attacher l’implant au crâne en appliquant une petite quantité de ciment dentaire entre le boîtier et la vis crânne la plus proche.
Après la première partie du ciment dentaire est guéri appliquer du ciment dentaire addition et fermer le trou au-dessus du crâne et l’ensemble du crâne exposé. Après avoir rincé les branchies du poisson avec de l’eau douce pour le réveiller, retirez le poisson du support et placez-le dans son réservoir d’origine. Assurez-vous que le poisson est capable de nager librement avec l’implant.
Le but de ces expériences est d’étudier comment l’activité neuronale des cellules individuelles code le comportement du poisson. Pour ce faire, un réseau de tétrode est implanté dans le télencéphale du poisson rouge nageant librement, ce qui permet d’enregistrer l’activité neuronale. L’activité cérébrale enregistrée est numérisée à 31 250 Hertz et la passe haute filtrée à 300 Hertz par l’enregistreur de données.
Ensuite, hors ligne, un filtre de passage d’interdiction est appliqué aux signaux et les données brutes présortées sont séparées dans le canal de chaque tetrode et le canal de référence. Les algorithmes de tri des pointes suivant sont utilisés pour caractériser l’activité d’une seule cellule. Tout d’abord, chaque canal est filtré manuellement par le seuil minimal d’amplitude des pointes.
Les pointes apparues dans plus d’un tetrode ou dans le canal de référence sont également filtrées. Les pointes détectées sont ensuite regroupées manuellement et filtrées par la forme, la longueur, l’intervalle inter-pointes et l’analyse des composants principaux. Il est important de vérifier l’intégrité de l’implant avant la chirurgie.
La tétrode peut être cochée à l’aide d’un compteur d’impédance standard et la boîte doit être vérifiée pour les fuites sous l’eau. Cette méthode peut être modifiée pour fonctionner avec de nombreux animaux aquatiques tant qu’ils sont assez grands pour contenir le système. Cela permet d’étudier le mécanisme neuronal qui sous-tend leur comportement.
