Ce protocole vise à utiliser des organoïdes cérébraux pour étudier les maladies mitochondriales. Il a été développé pour générer des organoïdes cérébraux reproductibles dans l’évaluation de leurs propriétés mitochondriales. Cette méthode ne nécessite pas de bioréacteurs coûteux et de procédures d’intégration fastidieuses.
Par conséquent, il est facile à mettre en œuvre et à mettre à l’échelle. Ce protocole permet de générer des organoïdes cérébraux reproductibles et de tester leurs propriétés mitochondriales. Cela peut conduire à l’identification de cibles interventionnelles pour les maladies mitochondriales incurables.
Pour commencer, cultivez des CSPi humaines dans des conditions sans mangeoire dans un milieu iPSC sur des plaques revêtues de six puits et conservez-les dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone. Passage des CSPi à 80% de confluence en utilisant un milieu de détachement sans enzyme dans des rapports allant de un par quatre à un par 12. Pour augmenter la survie cellulaire, ajoutez 10 micromolaires rho-associated protein kinase ou inhibiteur de ROCK après chaque fractionnement.
Dissocier les 80% iPSC au jour zéro. Préparez le milieu de différenciation corticale un ou CDM1 et préchauffez-le à température ambiante avant de l’ajouter aux cellules. Lavez les puits contenant les CSPi avec du PBS pour éliminer les cellules mortes et les débris.
Ajouter 500 microlitres de réactif A préchauffé à chaque puits et incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Vérifiez au microscope pour vous assurer du détachement des cellules. Ajouter un millilitre de milieu iPSC pour diluer le réactif A afin de neutraliser son activité.
Utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour dissocier les cellules en les canalisant de haut en bas et transférez la suspension de la cellule dans un tube centrifuge de 15 millilitres. Centrifugez doucement les cSPi à 125 fois G pendant cinq minutes à température ambiante, puis aspirez soigneusement le surnageant pour éviter de perturber la pastille cellulaire. Remettez en suspension la pastille avec un millilitre de CDM1 pour obtenir une suspension à cellule unique et compter le nombre de cellules.
Préparer le milieu d’ensemencement avec 9 000 cSPi pour 100 microlitres dans le MDP1 complété par 20 inhibiteurs micromolaires de ROCK, trois inhibiteurs micromolaires de la caténine WNT ou IWR-1 et cinq micromolaires SB-431542. Ajouter 100 microlitres de milieu d’ensemencement par puits à une plaque inférieure de 96 puits en V. Conservez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone.
Pour générer des neurosphères, le premier jour, observez que des agrégats de cellules rondes avec des bordures lisses définies se forment. Notez les cellules mortes autour des agrégats. Continuer à cultiver dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Le troisième jour, agitez la plaque en tapotant sur les côtés trois fois pour détacher les cellules mortes, puis ajoutez 100 microlitres de CDM1 complétés par 20 inhibiteurs micromolaires de ROCK, trois micromolaires IWR-1 et cinq micromolaires SB-431542 à chaque puits. Gardez la plaque à l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le sixième jour, retirez soigneusement 80 microlitres du milieu surnageant de chaque puits.
Évitez de toucher le fond du puits. Ajouter 100 microlitres de CDM1 complétés par trois micromolaires IWR-1 et cinq micromolaires SB-431542 à chaque puits et incuber la plaque. Répétez l’étape précédente tous les trois jours jusqu’au jour 18.
Le jour 18, pour transférer des neurosphères, préparez le CDM2 et ajoutez 10 millilitres à une plaque de culture cellulaire ultra faible de 100 millimètres. Utilisez une pipette de 200 microlitres avec la pointe coupée pour transférer les neurosphères rondes de la plaque de 96 puits à la plaque de culture cellulaire ultra faible de 100 millimètres. Retirer cinq millilitres de milieu de la plaque contenant les neurosphères et ajouter cinq millilitres de CDM2 frais.
Placez la plaque sur un agitateur orbital à 70 rotations par minute à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Tous les trois jours, aspirez soigneusement le milieu surnageant et remplacez-le par du CDM2 frais. Laissez une petite quantité du milieu pour empêcher les neurosphères de se dessécher.
Le jour 35, préparez le MDP3. Aspirer le milieu de la plaque et ajouter 10 millilitres de CDM3 froid. Après avoir changé le milieu, replacez la plaque sur un agitateur orbital à 70 rotations par minute à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Changez le milieu tous les trois à cinq jours en fonction du taux de croissance indiqué par la couleur du milieu. Le jour 70, préparez le MDP4. Utilisez le milieu CDM4 jusqu’à ce que l’âge souhaité des organoïdes soit atteint.
Pendant cette période, maintenez la plaque sur un agitateur orbital réglé à 70 rotations par minute à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Changez le milieu tous les trois à cinq jours en fonction du taux de croissance. Préparez une solution de PFA à 4 % et placez-la sous une hotte de sécurité.
Recueillez les organoïdes cérébraux et transférez-les doucement avec une pipette Pasteur en plastique émoussée de trois millilitres dans une plaque de six puits remplie de PFA. Conservez les organoïdes dans la solution de PFA pendant une heure à température ambiante. Retirez soigneusement le PFA avec une pipette Pasteur en plastique de trois millilitres et lavez les organoïdes fixes trois fois à l’aide de PBS.
Conservez les organoïdes fixes à quatre degrés Celsius dans pbS jusqu’à ce qu’ils soient utilisés ultérieurement. Les organoïdes générés à l’aide de ce protocole contiennent des neurones matures qui peuvent être visualisés à l’aide de marqueurs protéiques spécifiques aux axones et aux dendrites. Les organoïdes matures contiennent non seulement des cellules neuronales, mais aussi des cellules gliales.
En utilisant l’analyse des organoïdes cérébraux tranchés, il est possible de surveiller les axones positifs SMI 312 et les dendrites positives MAP2 ou les cellules gliales bêta S100. De plus, les images confocales aident à étudier la distribution détaillée et l’organisation des progéniteurs neuronaux SOX2 positifs en ce qui concerne les neurones positifs à la tubuline bêta-3. Les organoïdes cérébraux ont été colorés pour des marqueurs spécifiques aux mitochondries, tels que la translocase de la membrane externe ou TOM20.
Le profilage bioénergétique des organoïdes cérébraux a été réalisé en mesurant à la fois les métabolismes mitochondriaux à l’aide du taux de consommation d’oxygène, ou OCR, et le métabolisme glycolytique à l’aide du taux d’acidification extracellulaire, ou ECAR. L’oligomycine provoque une baisse du profil OCR et identifie donc l’OCR nécessaire à la production d’ATP. Lors du traitement à l’oligomycine, il peut également y avoir une augmentation compensatoire de l’ECAR, ce qui suggère que les cellules peuvent réguler à la hausse la glycolyse pour prévenir le stress métabolique.
Lors du transfert des neurosphères de la plaque de 96 puits vers une plaque de culture ou pendant la procédure de fixation, il est crucial de manipuler les organoïdes en douceur pour éviter de les endommager. Après la génération d’organoïdes cérébraux, l’imagerie multi-électrodes ou l’imagerie calcique seraient des méthodes idéales pour tester la fonctionnalité des organoïdes.
