Ce protocole est significatif, car le PIVEC permet l’exposition directe d’une culture cellulaire aux aérosols du monde réel. Le système peut être averti d’échantillonner le même air qu’une personne respire, permettant un nouveau type de surveillance de la qualité de l’air. Le principal avantage de cette technique est la facilité de capturer des aérosols sur les cellules pulmonaires de culture à des endroits inaccessibles aux systèmes de banc- dessus, comme à la source d’admission ou dans la zone de respiration.
Le Dr Lynn Secondo, récemment diplômée de mon laboratoire, et Nathaniel Wygal, étudiant de premier cycle de mon laboratoire, démontreront la procédure. Pour cette expérience, les matériaux d’essai stockés et l’environnement contrôlé pendant 24 heures avant le test. Pour assembler le système de dispersion sèche, connectez la valve à billes à une extrémité du tuyau fileté de quatre pouces de long et de 1/8 de taille.
Cela sert de trémie de particules. À travers l’extrémité ouverte de la trémie de particules, mettre dans la quantité désirée de nanoparticules de cuivre. Ensuite, fermez la trémie à particules avec une autre valve à billes.
Connectez le tuyau de deux pouces de long et 1/8 de taille à la vanne. Placez un tube extérieur de trois pouces de long et 1/2 pouce de diamètre autour du tuyau de deux pouces. Insérez un filtre HEPA à l’intérieur du tube court, en vous assurant que la direction d’écoulement passe par la valve à billes.
À l’aide du filetage, connectez le générateur de vide à l’autre soupape de boule. Ensuite, connectez le générateur de vide au réservoir d’air. Placez 1/4 pouce tube de diamètre extérieur sur la sortie du générateur de vide pour le connecter à la configuration expérimentale.
Tournez la vanne principale et les vannes de régulation sur le réservoir d’air pour régler le débit désiré. Ouvrez la valve à billes, la plus proche du filtre HEPA, puis ouvrez la valve à billes la plus proche du générateur de vide. Gardez-les ouverts pendant la caractérisation ou l’exposition avant de les fermer.
D’abord la valve à billes la plus proche du générateur de vide, puis la valve à billes la plus proche du filtre HEPA. Fermer les vannes principales et de régulation sur le réservoir d’air pour arrêter le débit. Pour nettoyer, utilisez 70 % d’éthanol pour laver les valves à billes et le générateur de vide.
Mettez les tuyaux métalliques dans l’autoclave pour la stérilisation. Après avoir culture des cellules à l’interface liquide de l’air, permettre aux cellules d’équilibrer pendant 24 heures. Pour assembler, prenez la base PIVEC avec le puits orienté vers le haut et connectez l’adaptateur d’insertion de culture cellulaire sur le dessus.
Ajouter quatre millilitres de médias de culture cellulaire au puits de la base du PIVEC à l’aide d’une micropipette. Utilisez des pinces à épiler pour placer l’insert de culture cellulaire dans l’adaptateur. Avec la partie étroite de la pièce supérieure PIVEC face vers le haut, connectez-vous à l’adaptateur.
Enveloppez soigneusement le PIVEC d’une seule couche de ruban adhésif. Poussez pour connecter des pièces de cassette de 37 millimètres sur le dessus et le bas de PIVEC. Placez des adaptateurs barbelés de 1/4 de pouce dans l’entrée et la sortie de cassettes.
Enroulez le réchauffeur résistatif autour de PIVEC avec les fils à la base. Bande à sécuriser. Envelopper le PIVEC de huit cartouches de papier d’aluminium pour obtenir de l’isolation et fixer avec du ruban adhésif.
Connectez le tube extérieur de 1/2 pouce de diamètre à l’adaptateur sur le dessus de PIVEC. Retirer les tubes poreux de l’eau stérile et les placer dans des tuyaux au-dessus du PIVEC. Transférer le système sur le capot de fumée et serrer le PIVEC sur le support d’anneau et fixer.
Connectez PIVEC au système d’aérosol en connectant le tube de 1/4 de pouce de diamètre à la sortie du générateur d’aérosols au tube poreux. Connectez la sortie du PIVEC à un tube de 1/4 de pouce de diamètre relié à un filtre HEPA et à une pompe à vide par un connecteur Y. Allumez les vannes et réglez le débit de la pompe à 0,5 litres par minute.
Exposez les cellules aux nanoparticules de cuivre pendant dix minutes avant de fermer les vannes et d’éteindre la pompe. Retirez le PIVEC du système d’aérosols. Sortez l’insert de culture cellulaire à l’aide d’une pince à épiler et placez-le dans la plaque stérile du puits pour commencer les analyses biologiques désirées.
Points de temps d’exposition proposés, remettre l’insert à l’incubateur de dioxyde de carbone. Aspirez les médias de PIVEC à l’aide d’un dropper. Utilisez 70 % d’éthanol pour laver le PIVEC et stériliser avec de la lumière ultraviolette pendant au moins 30 minutes avant la prochaine expérience.
Le PIVEC a été caractérisé à l’aide de trois tailles de nanoparticules de cuivre pour déterminer l’efficacité des dépôts. Des dépôts accrus sont observés dans l’ensemble pour la conception des 24 puits, puis la conception des six puits. Il diminue légèrement de 100 nanomètres par rapport aux particules de cuivre de 40 nanomètres et de 800 nanomètres.
La concentration en nombre de particules d’aérosols de nanoparticules de cuivre a été déterminée par sizer de particules de mobilité à balayage à base de filtre, ainsi que par des mesures optiques de la taille des particules. L’analyse post-exposition peut être accélérée en déterminant la relation de dose entre le filtre de 37 millimètres et l’insertion de culture cellulaire. La comparaison montre une forte corrélation pour les particules de cuivre de 800 nanomètres dont la valeur p est inférieure à 0,05.
Comparé aux systèmes d’exposition in vitro perpendiculaire-flow dans toute la littérature, l’efficacité de dépôt du PIVEC sur la gamme des tailles de particules testées est comparable, ou augmentée, aux valeurs rapportées. La chose la plus importante à retenir est que, bien que ce protocole démontre l’utilisation du PIVEC en laboratoire, il a été conçu pour mesurer les réponses cellulaires aux aérosols sur le site d’exposition. Lors des essais sur place, il est important de caractériser l’efficacité des dépôts de l’aérosol d’essai.
L’efficacité du dépôt détermine la dose déposée de particules auxquelles les cellules sont exposées. D’autres analyses biologiques peuvent être effectuées pour étudier plus de critères d’évaluation de réponse cellulaire en raison de l’exposition. Le PIVEC a été utilisé pour évaluer la réponse cellulaire due aux aérosols générés au cours des processus d’impression 3D, tels que le jetting liant métallique, et la fabrication de filament fondu.
L’utilisation de nanoparticules, en particulier sous forme d’aérosols, peut être dangereuse et toute exposition doit être effectuée dans un capot de fumée. Le travail cellulaire doit être effectué dans un cabinet de biosécurité.
