Cette méthode d’une dissection d’œnocyte et d’une coloration des gouttelettes lipidiques peut être utilisée pour réaliser l’apparition d’une gouttelette lipidique dans l’œnocyte des larves de drosophiles dans des conditions normales et stressées. Cette méthode fournit un outil utile pour étudier le métabolisme des lipides non seulement chez les insectes, mais aussi chez les mammifères avec seulement quelques modifications mineures. Pour induire la ponte, placez 150 mouches femelles vierges et 75 mâles des génotypes désirés dans une bouteille de ponte et placez la bouteille sous une boîte à l’épreuve de la lumière dans un incubateur de 25 degrés Celsius avec 60% d’humidité.
Après une heure, transférer les mouches dans une nouvelle bouteille et laisser les mouches pondre des œufs dans la nouvelle bouteille pendant une heure avant d’enlever les adultes. Ensuite, laissez les œufs se développer en larves de troisième stade pendant 84 heures à 25 degrés Celcius avec un cycle clair-obscurité de 12 heures. Avant d’entreprendre le traitement de famine, placez un morceau de papier filtre de taille appropriée dans une boîte de Pétri de six centimètres et ajoutez un millilitre de PBS sur le papier pour créer une chambre de famine.
Pour faire une chambre de traitement de contrôle, placez cinq millilitres de nourriture standard de semoule de maïs de Bloomington dans une boîte de Petri de six centimètres. Lorsque les chambres sont prêtes, utilisez un petit pinceau pour recueillir les larves de stade de la même taille approximative de la bouteille de ponte. Et 20 larves au hasard dans chaque famine et la chambre de contrôle.
Placez ensuite les chambres dans l’incubateur pendant 12, 24 ou 36 heures de développement et/ou de famine. À la fin de la période de traitement, utiliser des forceps pour transférer doucement les larves de chaque chambre dans une plaque de dissection contenant du PBS glacé et placer la plaque sous un microscope stéréo. Orientez le premier côté ventral de larve vers le haut et utilisez des forceps pour maintenir doucement la larve en place.
Placez une goupille à travers le pharynx et une autre broche à travers le spiracle pour fixer la larve à la plaque. Utilisez des ciseaux à ressort Vannas pour faire une incision longitudinale à travers l’épiderme de l’antérieur à l’extrémité postérieure de l’animal. Utilisez des forceps pour enlever le tissu interne de l’épiderme, en prenant soin d’éviter les dommages aux œnocytes à la surface interne de l’épiderme.
Ensuite, utilisez des forceps pour récupérer les broches de dissection et transférer l’épiderme dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre de PBS sur la glace. Pour la coloration des gouttelettes lipidiques, incuber l’épiderme disséqué dans le tampon de fixation pendant 30 minutes à température ambiante sur un rotateur, suivie d’une résuspension rapide en un millilitre de PBS. Lavez ensuite les échantillons avec trois lavages de cinq minutes dans un millilitre de PBS par lavage pour éliminer tout fixatif résiduel.
Après le dernier lavage, incuber les échantillons épidermiques avec une sonde lipophile appropriée pendant 30 minutes à température ambiante sur un rotateur. Pendant l’incubation, envelopper les tubes de l’échantillon dans du papier d’aluminium pour protéger les tissus de la lumière et laver les échantillons trois fois dans un millilitre de PBS pendant 10 minutes par lavage. Pour imager les œnocytes, transférez chaque échantillon d’épiderme en six microlitres de milieu de montage sur une lame de microscope propre, ajustez l’orientation du tissu, de sorte que la surface interne contenant les œnocytes touche le fond de la lame.
Placez délicatement un coverslip sur l’épiderme et scellez les bords avec du vernis à ongles clair. Lorsque le vernis a séché, l’image des échantillons sur un microscope confocal, mettre un grossissement 63 X avec l’excitation appropriée et les longueurs d’onde d’émission. Il y a quelques gouttelettes de lipides détectables dans les œnocytes des larves d’alimentation normales à différents stades de développement.
Comme observé dans ces images représentatives cependant, les gouttelettes de lipide augmentent en nombre dans les œnocytes en réponse aux périodes de famine de 12, 24, et 36 heures. Cette méthode fournit et facile et un protocole réalisable pour les chercheurs dans les domaines de recherche pertinents pour étudier si les manipulations génétiques ou environnementales provoquent des changements de gouttelettes lipidiques dans les cellules.
