Questo metodo di dissezione degli enociti e colorazione delle goccioline lipidiche può essere utilizzato per realizzare la comparsa di goccioline lipidiche negli enociti delle larve di drosofilia in condizioni normali e stressate. Questo metodo fornisce uno strumento utile per studiare il metabolismo lipidico non solo negli insetti ma anche nei mammiferi con poche piccole modifiche. Per indurre la deposizione delle uova, posizionare 150 mosche femminili vergini e 75 maschi dei genotipi desiderati in una bottiglia di deposizione delle uova e posizionare la bottiglia sotto una scatola a prova di luce in un'incubatrice di 25 gradi Celsius con umidità del 60%.
Dopo un'ora, trasferisci le mosche su una nuova bottiglia e lascia che le mosche depongono le uova nella nuova bottiglia per un'ora prima di rimuovere gli adulti. Quindi, lascia che le uova si sviluppino nelle terze larve instar per 84 ore a 25 gradi Celsius con un ciclo chiaro-scuro di 12 ore. Prima di iniziare il trattamento di fame, posizionare un pezzo di carta da filtro di dimensioni appropriato in una piastra di Petri di sei centimetri e aggiungere un millilitro di PBS sulla carta per creare una camera di fame.
Per creare una camera di trattamento di controllo, posizionare cinque millilitri di cibo standard di farina di mais Bloomington in una piastra di Petri di sei centimetri. Quando le camere sono pronte, utilizzare un piccolo pennello per raccogliere larve instar della stessa dimensione approssimativa dalla bottiglia di deposizione delle uova. E 20 larve casualmente in ogni fame e nella camera di controllo.
Quindi posizionare le camere nell'incubatore per 12, 24 o 36 ore di sviluppo e / o fame. Alla fine del periodo di trattamento, utilizzare le forcette per trasferire delicatamente le larve da ogni camera in una piastra di dissezione contenente PBS ghiacciato e posizionare la piastra al microscopio stereo. Orientare il primo lato ventrale della larva verso l'alto e utilizzare le forcep per tenere delicatamente la larva in posizione.
Posizionare un perno attraverso la faringe e un altro perno attraverso lo spiracolo per fissare la larva al piatto. Usa le forbici a molla Vannas per fare un'incisione longitudinale attraverso l'epidermide dall'estremità anteriore a posteriore dell'animale. Utilizzare le forcelle per rimuovere il tessuto interno dell'epidermide, facendo attenzione ad evitare danni agli enociti sulla superficie interna dell'epidermide.
Quindi utilizzare le pin di dissezione e trasferire l'epidermide in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri di PBS sul ghiaccio. Per la colorazione delle goccioline lipidiche, incubare l'epidermide sezionata in tampone di fissazione per 30 minuti a temperatura ambiente su un rotatore, seguita da una rapida risospensione in un millilitro di PBS. Quindi lavare i campioni con tre lavaggi di cinque minuti in un millilitro di PBS per lavaggio per rimuovere eventuali fissaggi residui.
Dopo l'ultimo lavaggio, incubare i campioni epidermici con un'appropriata sonda lipofila per 30 minuti a temperatura ambiente su un rotatore. Durante l'incubazione, avvolgere i tubi campione in un foglio per proteggere i tessuti dalla luce e lavare i campioni tre volte in un millilitro di PBS per 10 minuti per lavaggio. Per immaginire gli enociti, trasferire ogni campione di epidermide in sei microlitri di supporto su uno scivolo al microscopio pulito, regolare l'orientamento del tessuto, in modo che la superficie interna contenente gli enociti tocchi la parte inferiore della diapositiva.
Posizionare delicatamente un coverslip sull'epidermide e sigillare i bordi con smalto chiaro. Quando lo smalto si è asciugato, immagina i campioni su un microscopio confocale, metti un ingrandimento 63 X con le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate. Ci sono alcune goccioline lipidiche rilevabili all'interno degli enociti delle normali larve di alimentazione in diversi stadi di sviluppo.
Come osservato in queste immagini rappresentative, tuttavia, le goccioline lipidiche aumentano di numero all'interno degli enociti in risposta a periodi di fame di 12, 24 e 36 ore. Questo metodo fornisce e facile e un protocollo fattibile per i ricercatori in campi di ricerca pertinenti per indagare se le manipolazioni genetiche o ambientali causano cambiamenti di goccioline lipidiche nelle cellule.
