Este método de dissecção de enócitos e coloração de gotículas lipídicas pode ser usado para perceber o aparecimento de gotículas lipídicas em larvas de drosophila oenocito em condições normais e estressadas. Este método fornece uma ferramenta útil para estudar o metabolismo lipídico não apenas em insetos, mas também em mamíferos com apenas algumas pequenas modificações. Para induzir a colocação de ovos, coloque 150 moscas virgens fêmeas e 75 machos dos genótipos desejados em uma garrafa de colocação de ovos e coloque a garrafa sob uma caixa à prova de luz em uma incubadora de 25 graus Celsius com 60% de umidade.
Depois de uma hora, transfira as moscas para uma nova garrafa e deixe as moscas colocarem ovos na nova garrafa por uma hora antes de remover os adultos. Em seguida, permita que os ovos se desenvolvam na terceira larva instar por 84 horas a 25 graus Celcius com um ciclo claro-escuro de 12 horas. Antes de iniciar o tratamento de fome, coloque um pedaço de papel filtro de tamanho apropriado em uma placa de Petri de seis centímetros e adicione um mililitro de PBS no papel para criar uma câmara de fome.
Para fazer uma câmara de tratamento de controle, coloque cinco mililitros de alimentos de fubá padrão Bloomington em uma placa de Petri de seis centímetros. Quando as câmaras estiverem prontas, use uma pequena escova de tinta para coletar larvas instar do mesmo tamanho aproximado da garrafa de colocação de ovos. E 20 larvas aleatoriamente em cada fome e na câmara de controle.
Em seguida, coloque as câmaras na incubadora por 12, 24 ou 36 horas de desenvolvimento e/ou fome. Ao final do período de tratamento, use fórceps para transferir suavemente larvas de cada câmara para uma placa de dissecção contendo PBS gelado e coloque a placa sob um microscópio estéreo. Oriente o primeiro lado ventral da larva para cima e use fórceps para segurar suavemente a larva no lugar.
Coloque um pino através da faringe e outro pino através do espirro para fixar a larva na placa. Use a tesoura de mola Vannas para fazer uma incisão longitudinal através da epiderme do anterior para o posterior do animal. Use fórceps para remover o tecido interno da epiderme, tomando cuidado para evitar danos aos oenócitos na superfície interna da epiderme.
Em seguida, use fórceps para recuperar os pinos de dissecção e transferir a epiderme para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mililitro de PBS no gelo. Para coloração de gotículas lipídicas, incubar a epiderme dissecada no tampão de fixação por 30 minutos à temperatura ambiente em um rotador, seguido de uma rápida ressuspensão em um mililitro de PBS. Em seguida, lave as amostras com três lavagens de cinco minutos em um mililitro de PBS por lavagem para remover qualquer fixação residual.
Após a última lavagem, incubar as amostras epidérmicas com uma sonda lipofílica apropriada por 30 minutos à temperatura ambiente em um rotador. Durante a incubação, enrole os tubos de amostra em papel alumínio para proteger os tecidos da luz e lave as amostras três vezes em um mililitro de PBS por 10 minutos por lavagem. Para imaginar os oenócitos, transfira cada amostra de epiderme em seis microlitros de meio de montagem em um slide de microscópio limpo, ajuste a orientação do tecido, de modo que a superfície interna contendo os oenócitos esteja tocando a parte inferior do slide.
Coloque delicadamente uma mancha na epiderme e sele as bordas com esmalte claro. Quando o polonês secar, imagem as amostras em um microscópio confocal, coloque uma ampliação de 63 X com os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados. Existem algumas gotículas lipídicas detectáveis dentro dos oenócitos de larvas normais de alimentação em diferentes estágios de desenvolvimento.
Como observado nessas imagens representativas, no entanto, as gotículas lipídicas aumentam em número dentro dos oenócitos em resposta a períodos de fome de 12, 24 e 36 horas. Este método fornece um protocolo fácil e viável para pesquisadores em áreas de pesquisa relevantes para investigar se manipulações genéticas ou ambientais causam alterações lipídicas nas células.
