Этот метод вскрытия яйцеклеток и окрашивания липидных капель может быть использован для реализации появления липидной капли в монозофиле личинок оеаноцитов в нормальных и напряженных условиях. Этот метод является полезным инструментом для изучения метаболизма липидов не только у насекомых, но и у млекопитающих с некоторыми незначительными изменениями. Чтобы вызвать откладывать яйца, поместите 150 девственных самок мух и 75 самцов желаемых генотипов в бутылку для яйцекладки и поместите бутылку под светоустойкую коробку в инкубатор 25 градусов по Цельсию с влажностью 60%.
Через час перенесите мух в новую бутылку и дайте мухам отложить яйца в новую бутылку в течение одного часа, прежде чем удалить взрослых. Затем позвольте яйцам развиться в третью личинку звезды в течение 84 часов при 25 градусах Цельсия с 12-часовым светло-темным циклом. Прежде чем инициировать лечение голодания, поместите соответствующий размер кусок фильтровальной бумаги в шести сантиметре чашки Петри и добавить один миллилитр PBS на бумаге, чтобы создать голодную камеру.
Чтобы сделать камеру контроля обработки, поместите пять миллилитров Bloomington стандартной кукурузной муки пищи в шесть сантиметров Петри блюдо. Когда камеры будут готовы, используйте небольшую кисть краски для сбора личинок instar того же приблизительного размера из бутылки для выкладки яиц. И 20 личинок случайным образом в каждую голодную и контрольную камеру.
Затем поместите камеры в инкубатор на 12, 24 или 36 часов развития и/ или голодания. В конце периода лечения используйте типсы, чтобы аккуратно перенести личинки из каждой камеры в пластину вскрытия, содержащую ледяной PBS, и поместить пластину под стерео микроскопом. Сориентировать первую личиночковую вентраловую сторону вверх и использовать типсы, чтобы аккуратно удерживать личинку на месте.
Поместите один штифт через глотку, а другой булавку через spiracle для обеспечения личинки к пластине. Используйте весенние ножницы Vannas, чтобы сделать продольный разрез через эпидермис от передней до задней части животного. Используйте типсы для удаления внутренней ткани эпидермиса, заботясь, чтобы избежать повреждения овеномоцитов на внутренней поверхности эпидермиса.
Затем используйте типсы для извлечения рассечения булавки и передачи эпидермиса в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки PBS на льду. Для окрашивания липидных капель инкубировать рассеченный эпидермис в буфер фиксации в течение 30 минут при комнатной температуре на ротаторе, а затем быстрое повторное успение в один миллилитр PBS. Затем мыть образцы с трех пятиминутных моет в один миллилитр PBS за стирку, чтобы удалить любые остаточные фиксатор.
После последней стирки инкубировать эпидермальные образцы с соответствующим липофильным зондом в течение 30 минут при комнатной температуре на ротаторе. Во время инкубации, оберните пробные трубки в фольгу, чтобы защитить ткани от света и мыть образцы три раза в один миллилитр PBS в течение 10 минут за стирку. Для изображения эаноцитов перенесите каждый образец эпидермиса в шесть микролитров монтажной среды на чистом микроскопической слайде, отрегулируйте ориентацию ткани, чтобы внутренняя поверхность, содержащая оеаноциты, касалась нижней части слайда.
Аккуратно поместите крышку на эпидермис и запечатайте края четким лаком для ногтей. Когда польский высохнет, изображение образцов на конфокальный микроскоп, положить 63 X увеличение с соответствующим возбуждением и выбросов длин волн. Есть несколько обнаруживаемых липидных капель в моноцитах нормальных личинок кормления на разных стадиях развития.
Как отмечается в этих репрезентативных изображений однако, липидные капли увеличение числа в пределах эаноцитов в ответ на 12, 24 и 36-часовой периоды голодания. Этот метод обеспечивает и простой и осуществимый протокол для исследователей в соответствующих областях исследований, чтобы исследовать ли генетические или экологические манипуляции вызывают изменения липидных капель в клетках.
