このオエノサイト解剖および脂質液滴染色法は、正常かつストレス状態下のショウジョウバエ幼虫オエノサイトにおける脂質滴の出現を実現するために使用することができる。この方法は、昆虫だけでなく、わずかなわずかな変更を伴う哺乳類においても脂質代謝を研究するための有用なツールを提供する。産卵を誘発するには、150の処女雌ハエと75人の雄を産卵ボトルに入れ、湿度60%の25°Cインキュベーターで防光箱の下にボトルを置きます。
1時間後、ハエを新しいボトルに移し、ハエが大人を取り除く前に1時間新しいボトルに卵を産ませます。その後、卵が12時間の明暗サイクルで25度の摂氏で84時間3番目のインスター幼虫に発達することを可能にする。飢餓処理を開始する前に、適切なサイズのろ紙を6センチメートルのペトリ皿に入れ、PBSを1ミリリットルずつ紙に加えて飢餓室を作ります。
コントロール処理室を作るために、ブルーミントン標準コーンミール食品の5ミリリットルを6センチメートルのペトリ皿に入れます。チャンバーの準備ができたら、小さなペイントブラシを使用して、産卵ボトルから同じおおよその大きさのインスター幼虫を収集します。そして、各飢餓と制御室にランダムに20匹の幼虫。
その後、チャンバーを12時間、24時間、または36時間の発達および/または飢餓のためにインキュベーターに入れます。治療期間の終わりに、鉗子を使用して各チャンバーから氷冷PBSを含む解剖板に幼虫を穏やかに移し、プレートをステレオ顕微鏡の下に置きます。最初の幼虫側を上に向け、鉗子を使用して幼虫をそっと所定の位置に保持します。
1本のピンを咽頭に通し、もう1本のピンをスピラクルに通して幼虫をプレートに固定します。ヴァンナススプリングはさみを使用して、前から後端までの表皮を縦切り切りします。鉗子を使用して表皮の内部組織を除去し、表皮の内部表面上の耳球への損傷を避けるように注意してください。
次に鉗子を使用して解剖ピンを取り出し、表皮を氷上のPBSの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に移します。脂質滴染色の場合、解剖した表皮を固定バッファーに30分間、ローテーター上の室温でインキュベートし、続いてPBSの1ミリリットルで迅速な再懸濁液を行う。その後、1回の洗浄につき1ミリリットルのPBSで5分間の洗浄を3回行い、残留固定剤を取り除きます。
最後の洗浄後、回転器上の室温で30分間、適切な親油性プローブで表皮サンプルをインキュベートします。インキュベーション中に、サンプルチューブをホイルで包んで組織を光から保護し、PBSの1ミリリットルでサンプルを1回洗浄10分間3回洗浄します。オエノサイトを画像化するには、各表皮サンプルをきれいな顕微鏡スライド上の取り付け媒体の6マイクロリットルに移し、組織の向きを調整し、オエノサイトを含む内部表面がスライドの底部に触れ合う。
カバースリップを表皮にそっと置き、エッジを透明なマニキュアで密封します。研磨が乾燥したら、サンプルを共焦点顕微鏡上に画像化し、適切な励起波長と発光波長で63倍倍にします。異なる発達段階で正常な哺乳虫の耳球内に検出可能な脂質滴がいくつか存在する。
しかし、これらの代表的な画像で観察されるように、脂質滴は飢餓の12、24、および36時間の期間に応答して、オエノサイト内の数の増加します。この方法は、遺伝的または環境的操作が細胞内の脂質滴の変化を引き起こすかどうかを調査するために、関連する研究分野の研究者にとって容易かつ実現可能なプロトコルを提供する。
