Este método de una disección de ovenocito y la tinción de gotas lipídicas se puede utilizar para realizar la aparición de gotas lipídicas en el enocito de larvas de drosophila en condiciones normales y estresadas. Este método proporciona una herramienta útil para el estudio del metabolismo de los lípidos no sólo en insectos, sino también en mamíferos con sólo unas pocas modificaciones menores. Para inducir la puesta de huevos, coloque 150 moscas hembra vírgenes y 75 machos de los genotipos deseados en una botella de puesta de huevos y coloque la botella debajo de una caja a prueba de luz en una incubadora de 25 grados centígrados con 60% de humedad.
Después de una hora, transfiera las moscas a una botella nueva y deje que las moscas pongan huevos en la botella nueva durante una hora antes de retirar a los adultos. Luego, permita que los huevos se conviertan en las larvas de la tercera estrella durante 84 horas a 25 grados Celcius con un ciclo de 12 horas de luz-oscuridad. Antes de iniciar el tratamiento de hambre, coloque un pedazo de papel de filtro de tamaño adecuado en una placa Petri de seis centímetros y agregue un mililitro de PBS en el papel para crear una cámara de hambre.
Para hacer una cámara de tratamiento de control, coloque cinco mililitros de alimentos de harina de maíz estándar Bloomington en un plato Petri de seis centímetros. Cuando las cámaras estén listas, utilice un pequeño pincel de pintura para recoger larvas instar del mismo tamaño aproximado de la botella de puesta de huevos. Y 20 larvas al azar en cada inanición y la cámara de control.
A continuación, coloque las cámaras en la incubadora durante 12, 24 o 36 horas de desarrollo y/o inanición. Al final del período de tratamiento, utilice fórceps para transferir suavemente larvas de cada cámara a una placa de disección que contenga PBS frío y coloque la placa bajo un microscopio estéreo. Orientar el primer lado ventral de la larva hacia arriba y utilizar fórceps para sostener suavemente la larva en su lugar.
Coloque un alfiler a través de la faringe y otro alfiler a través del espiráculo para fijar la larva a la placa. Utilice las tijeras de resorte Vannas para realizar una incisión longitudinal a través de la epidermis desde el extremo anterior hasta el extremo posterior del animal. Utilice fórceps para extraer el tejido interno de la epidermis, teniendo cuidado de evitar daños a los oenocitos en la superficie interna de la epidermis.
A continuación, utilice fórceps para recuperar los pines de disección y transferir la epidermis a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de PBS sobre hielo. Para la tinción de gotas lipídicas, incubar la epidermis diseccionada en el tampón de fijación durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rotador, seguido de una resuspensión rápida en un mililitror de PBS. A continuación, lave las muestras con tres lavados de cinco minutos en un mililitro de PBS por lavado para eliminar cualquier fijador residual.
Después del último lavado, incubar las muestras epidérmicas con una sonda lipofílica apropiada durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rotador. Durante la incubación, envuelva los tubos de muestra en papel de aluminio para proteger los tejidos de la luz y lave las muestras tres veces en un mililitro de PBS durante 10 minutos por lavado. Para imaginar los enocitos, transfiera cada muestra de epidermis a seis microlitros de medio de montaje en una diapositiva de microscopio limpia, ajuste la orientación del tejido, de modo que la superficie interna que contiene los oenocitos toque la parte inferior de la diapositiva.
Coloque suavemente un cubreobjetos sobre la epidermis y selle los bordes con esmalte de uñas transparente. Cuando el esmalte se haya secado, imagine las muestras en un microscopio confocal, coloque un aumento de 63 X con las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas. Hay algunas gotas de lípidos detectables dentro de los ovenocitos de larvas de alimentación normal en diferentes etapas del desarrollo.
Sin embargo, como se observa en estas imágenes representativas, las gotas lipídicas aumentan en número dentro de los ovenocitos en respuesta a períodos de hambre de 12, 24 y 36 horas. Este método proporciona y proporciona un protocolo fácil y factible para que los investigadores en los campos de investigación relevantes investiguen si las manipulaciones genéticas o ambientales causan cambios en las gotas de lípidos en las células.
