Ce protocole est le système autologue pour la culture de fibroblastes humains avec le propre plasma riche en plaquettes du patient et une préparation standardisée pendant cinq minutes. Le PRP favorise une expansion cellulaire massive des fibroblastes en culture. Je vous recommande d’utiliser cette méthode en utilisant le PRP comme supplément cellulaire lorsque vous avez besoin d’une expansion massive de la crique et de la cellule sûre pour les thérapies cellulaires autologues.
Lorsque vous essayez ce protocole, je vous recommande de vérifier l’intégrité du PRP. Votre plasma doit être très propre en l’absence de globules rouges. Lorsque vous le transférez, vous devez le faire très soigneusement.
Et en ce qui concerne la digestion de vos tissus, ils doivent être très propres avant de procéder. Pour commencer, tournez soigneusement les tubes de plasma riche en plaquettes remplis de sang, ou PRP, à l’envers trois fois pour mélanger le sang avec un anticoagulant. Centrifuger les échantillons de sang à 1500g pendant cinq minutes dans un rotor fixe incliné de 45 degrés et équilibrer les tubes.
Après centrifugation, le sang fractionné a des globules rouges et blancs piégés sous le gel de séparation et les plaquettes à la surface du gel. Retourner doucement le tube PRP 20 fois pour remettre en suspension le dépôt plaquettaire dans le surnageant plasmatique. Assurez-vous que les plaquettes sont complètement détachées du gel et que le plasma doit passer de clair et transparent à trouble.
Prélever la solution plasmatique du tube à l’aide d’un dispositif de transfert connecté à une seringue de 10 millilitres. Placez les échantillons de peau dans un tube en polypropylène de 50 millilitres avec du PBS et secouez doucement le tube. Si l’échantillon de peau est relativement grand, placez-le sur le couvercle d’une boîte de culture tissulaire de 150 centimètres carrés avec le côté épidermique vers le bas.
Retirez le tissu adipeux sous-cutané à l’aide d’une pince et de ciseaux. Pour éviter que le tissu ne se dessèche, rincez-le toutes les quelques minutes dans du PBS. Lorsque l’élimination de la graisse est terminée, utilisez un scalpel pour couper les échantillons de peau en bandes, environ 0,5 par 1,5 centimètre.
Ensuite, ajoutez cinq millilitres de mélange collagénase / dispase dans un tube stérile de 15 millilitres. Transférer le tissu coupé dans le tube. Assurez-vous que les morceaux de tissu sont immergés dans la solution et refermez solidement le tube.
Placez les tubes dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec agitation orbitale pendant 150 minutes. Après l’incubation, déplacer le tube contenant le tissu dans l’enceinte de biosécurité. Placez le couvercle d’une boîte de culture stérile de 100 millimètres à l’envers dans l’enceinte de biosécurité.
Transférer la suspension de tissu au fond de la capsule de culture de 100 millimètres sans éclaboussures. S’il reste des morceaux de tissu dans le tube, utilisez une pipette stérile d’un millilitre ou une pince stérile pour transférer les morceaux au fond de la boîte de culture. Avec l’épiderme tourné vers le haut, tenez le derme avec une paire de pinces.
Saisissez le bord de l’épiderme avec une autre paire de forceps et épluchez le derme et l’épiderme. En gardant les morceaux séparés sur le même couvercle, placez les morceaux dermiques dans une nouvelle boîte de culture de 100 millimètres contenant du PBS. Ensuite, à l’aide d’une pince de laboratoire, transférer les morceaux dermiques dans un tube en polypropylène de 15 millilitres contenant trois millilitres de PBS à 0,3% de trypsine.
Incuber le tube dans un bain-marie de 37 degrés Celsius et mélanger le contenu toutes les deux à trois minutes en retournant le tube plusieurs fois. Après 10 à 20 minutes, arrêtez la réaction en ajoutant trois à cinq millilitres de milieu de croissance complet glacé. Vortex le tube vigoureusement plusieurs fois.
Filtrez la suspension, qui contient les fibroblastes, à travers un filet de nylon de 85 microns dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger la solution de fibroblastes à 150g pendant 10 minutes. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 à 200 microlitres de milieu de croissance complet pour le nombre de cellules.
Plaquer les cellules dans une fiole de culture tissulaire de 25 centimètres carrés. Ensuite, incuber la fiole à 37 degrés Celsius. Changez le milieu qui contient des cellules non adhérentes le lendemain, et de nouveau, tous les trois ou quatre jours.
Lorsque les fibroblastes atteignent 70 à 80% de confluence, lavez-les avec du PBS et ajoutez une solution de trypsine-EDTA. Après avoir incubé le ballon pendant trois minutes à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction en ajoutant trois à cinq millilitres de milieu de croissance complet chaud. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire à 200g pendant cinq minutes.
Retirer le surnageant par aspiration. Culture des fibroblastes en milieu PRP et incuber à 37 degrés Celsius. La densité cellulaire minimale recommandée est de 4 000 cellules viables par centimètre carré.
Un dispositif médical dédié a été utilisé pour produire du PRP en traitant le sang total de 10 patients différents. L’appareil a éliminé la majorité des globules rouges et des globules blancs. La concentration plaquettaire moyenne dans le PRP était d’environ 50% plus élevée que la concentration plaquettaire dans le sang total.
Les fibroblastes autologues ont été cultivés en milieu avec 10%FBS ou en milieu avec des concentrations de PRP allant de un à 50%Après sept jours de culture, sans changer le milieu, les cultures amorcées avec 20%PRP présentaient un nombre plus élevé de fibroblastes viables. Le PRP a eu des effets puissants en tant que booster de prolifération jusqu’à 7,7 fois par rapport au FBS. La coloration à la phalloïdine a montré que le changement morphologique observé lors de l’activation du PRP était lié à la réorganisation de la F-actine, qui est une signature de l’activation des fibroblastes.
Une préoccupation majeure de l’expansion cellulaire rapide est le risque de modification génomique. Afin d’évaluer cela, vous pouvez effectuer un test d’hybridation génomique comparative pour évaluer la stabilité génomique de vos cellules. Le principal avantage de cette technique est de remplacer FBS par un PRP, qui est un supplément biologique autologue plus puissant.
Avec cela, le chercheur peut développer plus de cellules plus rapidement sans aucun ajout de substances xénogéniques. Nous pouvons utiliser cette technique pour d’autres types de cellules qui nécessitent une expansion ex vivo avant l’application clinique, par exemple, les cellules souches kératinocytaires ou mésenchymateuses.
