Live-Cell Bdellovibrio bacteriovorus imagerie a été difficile en raison du cycle de vie complexe de ces bactéries prédatrices. Notre protocole permet de surveiller les étapes du cycle de vie complet en temps réel. Bien que notre protocole soit basé sur des souches d’égalisation spécifiques, il peut être facilement adapté à une variété de souches bactériennes, y compris les souches pathogènes.
Pour mettre en place une culture B.bacteriovorus, combinez un millilitre de bactéries fraîches de culture 24 heures sur 24 avec trois millilitres de culture de proies nocturnes dans un flacon de 250 millilitres contenant 50 millilitres de tampon hippies calcium complété par des antibiotiques au besoin. Après une incubation de 24 heures à 30 degrés Celsius et 200 révolutions par minute, vérifiez que les cellules proies ont été entièrement lysées par microscopie à contraste de visage montée par liquide. De nombreuses cellules B.bacteriovorus à plusieurs attaques progressives devraient être présentes et aucune cellule ou bdelloplaste d’E.coli ne doit être visible.
Filtrer la culture B.bacteriovorus à travers un filtre de taille pore de 0,45 micromètre dans un tube conique de 50 millilitres et suspendre le filtrate dans une centrifugeuse. Puis re-suspendre la pastille B.bacteriovorus en trois millilitres de calcium hippies tampon à une densité optique finale à 600 nanomètres d’environ 0,2 et incuber les bactéries à 30 degrés Celsius et 200 révolutions par minute pendant 30 minutes. Pour préparer les cellules hôtes, choisissez une seule colonie de la souche hôte d’intérêt et de noduler les bactéries en 10 millilitres de YT moyen complété par des antibiotiques si nécessaire pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 180 révolutions par minute.
Le lendemain matin transférer deux millilitres de la culture de nuit à un tube à essai de deux millilitres et pelleter les cellules par centrifugation. Puis re-suspendre la pastille dans 200 microlitres de calcium hippies tampon. Il est très important de suspendre complètement la pastille cellulaire entière après centrifugation pour s’assurer que la cellule proie est séparée au niveau d’une seule cellule.
Pour préparer les cellules à la microscopie de fluorescence en accéléré, tout d’abord, mélanger 200 milligrammes d’agarose de faible teneur moléculaire fluorescente avec 20 millilitres de calcium hippies tampon et dissoudre l’agarose dans un micro-ondes. Verser trois millilitres de l’agarose fondue dans un plat de fond en verre de 35 millimètres et permettre à l’agarose de se solidifier. À l’aide d’une micro spatule de laboratoire, retirer soigneusement le tampon d’agarose du plat sans déranger le poteau central de la garniture et placer le côté inférieur de garniture vers le haut sur un couvercle de plat de Petri.
Placez cinq microlitres de la suspension concentrée de la cellule hôte sur le tampon retourné et utilisez une boucle d’inoculation pour répartir les cellules dans le pôle central. Ajouter ensuite cinq microlitres de la suspension concentrée B.bacteriovorus sur la surface enduite de cellules hôtes sans se propager et retourner rapidement le gel sur le côté inférieur en verre de 35 millilitres vers le bas vers le bas. Couvrir ensuite le plat d’un couvercle.
Pour la microscopie Time-Lapse Florescence de la co-culture, placez le plat dans un porte-plat Petri de sorte que le plat ne se déplace pas au cours de l’expérience et placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif du microscope inversé et une goutte sur le fond du plat. Montez le support sur l’étape du microscope à l’intérieur de la chambre de microscope inversée et dans le logiciel de microscope réglez le grossissement à 100X et la lentille polychrome à GFP et Mcherry. À l’aide d’un iPS à Brightfield, localisez le plan focal et ouvrez le gestionnaire inutile.
Déplacez la scène et utilisez le bouton points de marque pour stocker les coordonnées d’au moins 10 positions d’intérêt. Passez de l’iPS à l’écran. Réglez le plan focal et cliquez sur le bouton de point de remplacement dans l’inutile de gestionnaire pour calibrer chaque point.
Ouvrez la boîte d’empilage de la maladie de concepteur d’expérience et de non-marque. Sélectionnez les canaux fluorescents appropriés et les paramètres d’élimination optimaux et définissez les intervalles entre l’acquisition de l’image et le temps total de l’expérience. Activez la maintenance de mise au point pour les positions choisies et sélectionnez le dossier de données dans lequel les fichiers d’image doivent être enregistrés automatiquement.
Revérifiez tous les paramètres du contrôle logiciel microscope et démarrez l’expérience time-lapse. Après la première heure de l’expérience, vérifiez que toutes les positions de la scène sont toujours au point. Lorsque l’expérience time-lapse est terminée, retirez la boîte de Petri et jetez le plat de 35 millimètres avec un tampon d’agarose selon les protocoles de biosécurité appropriés.
Pour le traitement des données d’image en accéléré, transférez les données expérimentales à un ordinateur chargé du logiciel Fidji et ouvrez une image aux Fidji. Dans les options d’importation de bio-formats, sélectionnez la pile de vue avec hyperstack. En mode couleur composite, sélectionnez l’échelle automatique.
En faisant défiler les piles d’images, évaluez si les cellules et les bdelloplastes sont restées au point au cours de l’expérience. Si les taches fluorescentes vertes de l’ADN et du vert mNeon sont présentes dans les cellules B.bacteriovorus à l’intérieur des bdelloplastes tout au long de la phase de croissance et si toutes les étapes du cycle de vie prédateur peuvent être visualisées. Pour analyser un b.bacteriovorus cell bdelloplast particulier, utilisez un outil de sélection pour marquer la cellule d’intérêt.
Ensuite, dupliquez la région choisie. Dans l’image dupliquée, cliquez sur le processus et lisse et pour chaque canal fluorescent, cliquez sur l’image, la couleur, les outils de canaux, et sélectionnez le canal d’intérêt. Cliquez ensuite sur l’image, ajustez et le contraste de luminosité pour ajuster la luminosité et le contraste de l’image dans chaque canal.
Pour ajouter une barre d’échelle, sélectionnez analyser, outils et barre d’échelle. Pour ajouter une lampe de temps aux images, cliquez sur les images, les piles et l’horodatage. Pour enregistrer les images modifiées, sélectionnez TIF.
Pour enregistrer les données sous forme de séquence d’image, AVI pour produire un film, ou PNG pour enregistrer une seule image du cadre actuel. Ce système à base de microscopie à fluorescence Time-Lapse permet le suivi en temps réel des cellules B.bacteriovorus individuelles et fournit des informations précieuses sur chaque étape du cycle de vie prédateur complexe. La fusion mCherry piluleuse permet à l’ensemble de la cellule prédatrice d’être étiquetée dans la phase d’attaque ainsi qu’au stade précoce de la phase de croissance.
La transition de l’attaque à la phase réplictive peut être visualisée non seulement par la formation bdelloplast hôte, mais aussi par l’apparition du réplicateur. Le réplicant est assemblé au pôle cellulaire envahissant et plus d’un réplicant peut être observé dans un filament B.bacteriovorus croissant au fur et à mesure que la phase de reproduction progresse. Après plusieurs copies du chromosome sont synthétisées, la réplication est terminée.
Enfin, le filament multinucléated subir une septation et les cellules de descendance sont libérés de la bdelloplast. Les cellules B.bacteriovorus devraient être suffisamment matérielles pour rechercher activement leurs proies et toute la densité cellulaire devrait être suffisamment élevée pour permettre l’attachement des cellules prédatrices. Cette plate-forme peut être utile dans des expériences impliquant des agents pathogènes multirésistants et pour faciliter l’amélioration du génie génétique du B.bacteriovorus en tant qu’antibiotique vivant en médecine humaine et vétérinaire.
