Ce protocole fournit un modèle robuste et reproductible de l’accumulation d’alpha synucléine dans les neurones dopaminergiques primaires pour étudier les mécanismes et les traitements qui peuvent réguler cette accumulation. Les fibrilles alpha-synucléine préformées induisent une accumulation progressive et hautement reproductible de protéines combinée à l’imagerie automatisée et à l’analyse impartiale de l’image, ce protocole facilite un criblage relativement rapide, moyen à élevé, de l’accumulation d’alpha-synucléine inhibant les camions. L’accumulation progressive d’alpha-synucléine peut être l’un des facteurs compromettant la fonction neuronale dans la maladie de Parkinson et certains corps nucléaires.
De nouvelles molécules bloquant une telle accumulation peuvent devenir de nouvelles thérapies pour la neurodégénérescence. Nous croyons que ce protocole est une étape importante pour établir un outil standard et fiable pour étudier les mécanismes moléculaires régulant l’accumulation d’alpha-synucléine dans les neurones dopaminergiques. Julia Konovalova, doctorante de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Avant de mettre en place la culture primaire embryonnaire des cellules midbrain, ajouter 50 microlitres de dopamine, le milieu neuronal, à chaque puits de la plaque de puits Poly-L-Ornithine enduit 96 et utiliser une pointe de pipette de 100 microlitres pour aspirer le milieu tout en grattant simultanément le fond de chaque puits dans une direction circulaire pour enlever le revêtement au périmètre de chaque puits. Une île recouverte de Poly-L-Ornithine restera au milieu de chaque puits. Ajouter 10 microlitres de milieu au milieu de chaque île enduite pour créer des micro-îles.
Mettre en place des cultures primaires embryonnaires de midbrain à partir de souris embryonnaires jour 13,5 embryons de souris. Mettre en commun tous les planchers de midbrain récoltés dans le même tube de 1,5 millilitre et laver les échantillons trois fois avec 500 microlitres de calcium et de magnésium sans HBSS par lavage. Après le dernier lavage remplacer le HBSS avec 0,5% trypsine pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation ajouter 500 microlitres d’un DNase I fraîchement préparé dans la solution FBS au tissu partiellement digéré et utiliser une pipette en verre siliconisé avec une pointe polie par le feu pour triturer le tissu. Lorsque seules de minuscules particules à peine visibles peuvent être observées, ces fragments de tissu s’installent au fond du tube de micro centrifugeuse et transfèrent ce supernatant dans un tube conique de polypropylène vide de 15 millilitres. Ajouter un millilitre de HBSS au tube contenant du DNase I dans FBS et mélanger plusieurs fois par pipetting.
Transférez un millilitre de cette solution aux particules de tissu restantes et triturez à nouveau les échantillons. Puis tirez la suspension cellulaire digérée avec le tube de supernatant sans transférer les fragments de tissu restants après avoir trituré l’échantillon de tissu une fois de plus avec les autres DNase I et FBS dans les sédiments HBSS les cellules collectées par centrifugation et aspirer le supernatant sans déranger la pastille. Lavez les cellules deux fois en deux millilitres de neurones dopaminergiques réchauffés par lavage.
Et résuspendez les cellules à trois fois 10 aux cellules de force par six microlitres de concentration chaude et moyenne fraîche dans un tube de micro centrifugeuse. Ensuite, retirez le milieu de chaque micro-île préparée précédemment et mélangez les cellules avec du pipetage doux avant d’utiliser une pipette de 10 microlitres pour ajouter six microlitres de cellules à chaque micro-île. Lorsque toutes les cellules ont été ajoutées, remplissez les puits vides sur les bords de la plaque de 150 microlitres d’eau ou de PBS et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure.
À la fin de l’incubation ajouter 100 microlitres de neurones dopaminergiques frais milieu à chaque puits et retourner la plaque à l’incubateur. Le huitième jour de la culture cellulaire dans un capot d’écoulement laminaire ajouter à 3,75 microlitres de 100 microgrammes par millilitre de fibrilles préformées à chaque puits expérimental, et 3,75 microlitres de PBS à chaque puits de contrôle. Lorsque vous travaillez avec pfs être prudent au sujet de la contamination non désirée des protéines et ensuite nettoyer le capot et tous les instruments associés PF avec 1%SDS et 70% éthanol.
Au point de terminaison expérimental approprié après coloration pour les marqueurs d’intérêt, chargez la plaque de culture de puits 96 sur un scanner de plaque à haute teneur équipé d’un objectif de 10 X. Ajustez les réglages en fonction des spécifications de la plaque de puits 96 comme le type de jeu, le fabricant, la taille, la distance entre les puits, et le type et le volume du milieu. Sélectionnez la zone d’imagerie des puits pour couvrir toutes les cellules de chaque micro-île et utilisez un puits pour ajuster l’accent automatique sur l’expression DAPI.
Calibrer le temps d’acquisition pour chaque canal fluorescent en fonction de l’intensité de la coloration dans les puits de contrôle et ajuster les paramètres de sorte que les cellules dopaminergiques dans les puits de contrôle préformés fibril traités hébergeant de la phosphoserine 129 agrégats alpha synucléine dans le soma cellulaire clairement être distingué permettant une quantification sans ambiguïté de la phosphoserine 129 alpha synucléine cellules positives et négatives. Puis l’image de tous les puits sélectionnés simultanément dans tous les canaux en utilisant exactement les mêmes paramètres pour chaque puits. Pour l’analyse des images, ouvrez CellProfiler analyste et sélectionnez le V2_THpos.
fichier propriétés. Pour trier les cellules segmentées en phosphoserine 129 cellules positives et négatives alpha synucléine d’abord définir le nombre de cellules d’extraction à 50 cellules aléatoires et cliquez chercher à charger des images des cellules segmentées. Faites glisser au moins 30 cellules dans le bac correspondant au bas de la fenêtre.
sélectionnez utiliser un boost rapide et doux avec 50 règles max ou des classificateurs forestiers aléatoires et cliquez sur train. Ensemble aller chercher à 50 cellules positives et cliquez chercher à acquérir exemple positive phosphoserine 129 cellules alpha synucléine marqué selon le classificateur de train ou ensemble aller chercher à 50 cellules négatives et cliquez chercher à acquérir exemple négatif phosphoserine 129 cellules alpha synucléine selon le classificateur de train. Lorsque les résultats sont satisfaisants, cliquez sur le score tout pour générer un tableau de résultats résumant le nombre de phosphoserine 129 alpha synucléine positive et négative neurones dopaminergiques dans chaque puits.
Quelques jours après le placage, une culture homogène peut être observée par microscopie légère dans la micro-île créée avant le placage. Les neurones primaires s’installent sur le fond de la plaque enduite de façon homogène et établissent des projections neuronales. Sur cette image, on peut observer une petite touffe de cellules de moins de 150 micromètres de diamètre.
La coloration immuno du contrôle des cultures primaires de souris mi-cérébrales non traitées avec des marqueurs cellulaires neuronaux 15 jours après le placage révèle un attachement restreint des cellules dans les micro-îles au milieu des puits de plaque. Neurones dopaminergiques immuno étiquetés avec marqueur hydroxylase tyrosine répartis autour de la micro-île dans un monocouche séparé les uns des autres sans aucune agglutination. Dans les cultures préformées de fibril alpha-synucléine, des inclusions positives d’alpha synuclein de pS129 peuvent également être observées.
Le traitement avec des fibrilles préformées in vitro pendant sept jours ne cause pas une diminution significative des nombres positifs de neurones d’hydroxylase de tyrosine comparés à d’autres groupes expérimentaux. Le traitement avec le facteur neurotrophique dérivé de ligne de cellules gliale cependant, réduit le pourcentage de pS129 alpha-synuclein inclusion positive, hébergeant les neurones positifs de dopamine d’hydroxylase de tyrosine. Avant de créer des micro-îles, assurez-vous que les puits enduits d’ornithine Poly-L sont solidement lavés.
Assurez-vous également d’utiliser des médias frais lors du placage de nouvelles cultures cérébrales. La méthode peut être combinée avec l’édition de gènes et les inhibiteurs pharmacologiques pour étudier les effets de gènes spécifiques et les ondes de pensée sur l’agrégation des noyaux. Nous utilisons régulièrement cette méthode pour dépister de nouvelles molécules qui inhibent l’accumulation d’alpha synucléine.
Ont démontré les effets protégés de l’accumulation du TDN et analysent actuellement plusieurs petites molécules candidats.
