Ce travail a été soutenu par le Bone Disease Program of Texas Award, le Caroline Wiess Law Fund Award et le NIAMS des National Institutes of Health sous les numéros de prix R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 à D.P.  Nous remercions M.E. Dickinson et T.J. Vadakkan dans le BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core et le BCM Advanced Technology Cores avec le financement des NIH (AI036211, CA125123 et DK056338).
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Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine.
1. Préparation de la souris
<ol><li>Croisez des souris Mx1-Cre17 et Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 (achetées au jackson Laboratory) avec des souris αSMA-GFP (fournies ici par les Drs Ivo Kalajzic et Henry Kronenberg) pour générer des souris rapporteures Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) (Figure 2A).</li>
	<li>Pour l’induction Mx1-Cre, injecter aux souris 25 mg/kg de pIpC tous les deux jours pendant 10 jours.</li>
	<li>Irradier des souris avec 9,5 Gy 1 jour avant la transplantation intraveineuse de 1 x 106 cellules mononucléaires de moelle osseuse entières de souris sauvages C57BL/6 (WT-BMT)19.</li>
	<li>Après 6 à 8 semaines de récupération, soumettez les souris à l’imagerie in vivo du protocole de migration cellulaire périostée décrit ci-dessous. REMARQUE: L’irradiation et le WT-BMT des souris Mx1-Cre sont nécessaires pour éliminer les cellules hématopoïétiques marquées mx1 de manière endogène qui peuvent répondre à une blessure. Six à huit semaines après l’irradiation, le nombre de cellules hématopoïétiques de l’hôte est à <5 % et donc prêt pour l’imagerie19.</li>
</ol>2. Dispositif de retenue de souris et support d’imagerie
<ol><li>Créez un dispositif de retenue pour souris avec un tube conique de 50 mL (Figure 1A).<ol>
<li>À l’aide de ciseaux pointus, percez un trou dans le fond du conique. Couper du trou inférieur au sommet du conique (le côté coupé sera le haut du dispositif de retenue).</li>
		<li>Faites une coupe d’environ 4 à 5 cm de long parallèlement à la coupe précédente et à mi-chemin (~2 cm) du haut du dispositif de retenue. Enlevez cette section du conique et lissez les bords étaient nécessaires.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construisez un support d’imagerie à tube conique à l’aide d’une plaque d’angle réglable, d’un poteau optique de 0,5 po et d’une pince à angle droit pour le poteau de 0,5 po, hexagonal de 0,1875 po (Figure 1B et table des matériaux).<ol>
<li>Ajustez la plaque d’angle à un angle de 35°. Sur le côté gauche de la plaque d’angle, vissez le poteau optique dans le deuxième trou à partir de l’arrière de la plaque.</li>
		<li>Sur le côté droit de la plaque réglable, insérez une vis à molette hexagonale de 0,25 pouce à ressort de 0,1875 po à ressort dans le deuxième trou à partir de l’avant et les derniers trous de la plaque. La pince à angle droit sera utilisée avec le poteau optique pour fixer le dispositif de retenue conique de la souris en place.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Intervention chirurgicale préopératoire
<ol><li>Anesthésie de la souris<ol>
<li>Pour la gestion de la douleur, injecter par voie sous-cutanée à la souris de la buprénorphine à libération prolongée (1 mg/kg p.c.) 30 à 60 minutes avant la chirurgie.</li>
		<li>Anesthésier les souris à l’aide d’une anesthésie par combinaison CCM (combo III) de rongeurs contenant 37,5 mg/mL de kétamine, 1,9 mg/mL de xylazine et 0,37 mg/mL d’acépromazine. La posologie appropriée pour les souris est de 0,75 à 1,50 mL par 1 kg de poids corporel. La dose durera de 30 à 45 minutes.</li>
		<li>Une fois la souris anesthésiée, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux avec un coton-tige stérile pour prévenir la déshydratation des yeux.</li>
		<li>Pour l’imagerie à long terme (>45 min), administrer à nouveau l’anesthésie pour maintenir une profondeur d’anesthésie appropriée comme suit.<ol>
<li>Préparer une seringue de 1 mL avec une quantité suffisante de combo III pour maintenir l’anesthésie pendant la durée d’imagerie prévue (0,75 mL/kg p.c. par 30 min de sédation supplémentaire). Fixez un ensemble de perfusion d’aiguille papillon de 25 G avec un tube de 12 po à la seringue et poussez l’anesthésique à travers le tube et l’aiguille.</li>
			<li>Insérez l’aiguille papillon par voie intrapéritonéale, puis collez l’aiguille en place. REMARQUE: C’est ainsi que le combo III supplémentaire sera administré pendant l’imagerie de sorte qu’il n’est pas nécessaire de déplacer l’animal ou de perturber le plan de vue.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fournir un support thermique avec un coussin chauffant maintenu à 37 ° C tout au long de la procédure. Pour une imagerie prolongée (>1 heure), un support de fluide supplémentaire sera nécessaire.  Des liquides supplémentaires peuvent être fournis par voie intraveineuse avec un Combo III supplémentaire pendant l’imagerie ou une solution saline de 33 mL/kg (0,9 NaCl) par voie sous-cutanée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contention de la souris et préparation du site chirurgical<ol>
<li>Utilisez des tondeuses pour enlever autant de poils que possible du haut de la tête. Appliquez la crème dépilatoire sur la zone rasée pour enlever les poils restants au site chirurgical.</li>
		<li>Assurez-vous que la souris est entièrement anesthésiée par un manque de réponse aux pincements d’orteils. Après 15 min, si la souris n’est pas complètement anesthésiée, administrer une deuxième dose plus faible de combo III (<0,75 mL/kg p.c.).</li>
		<li>Placez la souris dans la queue de retenue en premier, en la faisant glisser suffisamment vers l’arrière pour que le nez pende légèrement au-dessus du bord du conique.</li>
		<li>Collez les pattes avant au fond du tube conique à l’aide de ruban adhésif médical.</li>
		<li>Placez le tube conique avec la souris sur un support d’imagerie réglé à un angle de 35° et fixez-le à l’aide de la pince à angle droit (Figure 1C).</li>
		<li>Une fois la souris fixée dans le support d’imagerie, nettoyez le site chirurgical 3x avec des gommages alternés de gommage à la bétadine et d’alcool isopropylique à 70%. Encore une fois, vérifiez que l’animal est complètement sous sédation.</li>
		<li>Déplacez la souris sur un tampon absorbant propre et placez un drapé sur la souris pour créer un grand champ stérile.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Intervention chirurgicale
<ol><li>Incision d’ouverture<ol>
<li>À l’aide d’une pince à pointe fine, ramassez la peau immédiatement médiale jusqu’à l’oreille droite. Avec des ciseaux à microdissection, coupez la peau maintenue par la pince. REMARQUE: Initier l’incision en utilisant la méthode décrite ci-dessus crée une incision arrondie qui convient mieux à la suture après la procédure.</li>
		<li>Faites une incision transversale à partir de l’incision initiale vers l’oreille gauche (<1 cm).  Faites une autre incision, à partir de l’incision initiale, vers le nez de l’animal (~ 2–3 mm après l’œil droit).</li>
		<li>Séparez la peau du périoste à l’aide de la pince et des ciseaux pour couper doucement à travers le tissu conjonctif séparant la peau du périoste de calvaria.</li>
		<li>À l’aide d’un coton-tige stérile, appliquez une pommade ophtalmique sur le dessus du lambeau de peau.  Ramassez doucement le lambeau de peau et pliez-le sur l’œil gauche. L’intersection des sutures sagittales et coronales doit être clairement exposée (Figure 1E). REMARQUE: La pommade ophtalmique est utilisée pour maintenir le lambeau de peau en place.</li>
		<li>Rincez la surface ouverte avec du PBS stérile pour nettoyer la zone de tout sang et poils résiduels. REMARQUE: Si nécessaire, utilisez une pince à pointe fine pour enlever les poils qui restent après le rinçage, mais veillez à ne pas endommager le périoste.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microfracture<ol>
<li>Pour générer des microfractures sur la calvaire, retirez le piston d’une seringue à insuline de 29 G et coupez l’extrémité arrière de la seringue, autour des marques de 300 à 400 uL. REMARQUE: Cette étape facilite la manœuvre sous une portée de dissection lors de la production de la blessure.</li>
		<li>Placez l’extrémité d’un biseau (une à deux largeurs d’aiguille) vers le nez à partir de la suture coronale et une à deux largeurs d’aiguille à droite de la suture sagittale (Figure 1E).</li>
		<li>Faites tourner doucement la seringue dans le sens des aiguilles d’une montre, puis dans le sens inverse des aiguilles d’une montre plusieurs fois. REMARQUE: Chez les jeunes souris, une très petite quantité de pression vers le bas est nécessaire pour créer une microfracture circulaire. Veillez à ne pas laisser l’aiguille pénétrer dans le cerveau, car cela provoquerait des saignements et interférerait avec l’imagerie.</li>
		<li>Utilisez une aiguille de 27 G pour élargir la microfracture à ~0,4 mm. S’il reste des fragments d’os dans la microfracture, rincez la zone avec du PBS. S’il reste encore des fragments d’os dans la microfracture, utilisez l’aiguille de 29 G pour les extraire doucement.</li>
		<li>Répétez les étapes 4.2.1 à 4.2.4 pour créer une blessure sur le côté gauche de la suture sagittale. REMARQUE: À ce stade, il existe deux options: 1) procéder immédiatement au traitement par CCL5 (rubrique 4.3) et à l’imagerie (rubrique 5); ou 2) fermer le site chirurgical à la suite des procédures postopératoires visées à la rubrique 6. 24 heures plus tard, anesthésiez à nouveau la souris, rouvrez la vue chirurgicale, traitez la blessure avec CCL5 (rubrique 4.3) et effectuez une imagerie intravitale (section 5) et des soins postopératoires (rubrique 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Traitement CCL5<ol>
<li>À partir d’un stock de RANTES (100 ng/mL), fabriquer une solution de 10 ng/mL à l’aide d’une matrice à membrane basale (Table des matériaux). Conservez cette solution sur la glace pour garder la matrice sous forme liquide.</li>
		<li>Traiter chaque blessure avec 2 μL de CCL5 (10 ng/μL) à l’aide d’une pipette de 2 à 20 μL (cette pointe de pipette a un diamètre plus grand, ce qui est plus efficace lors de l’utilisation d’un liquide visqueux). Laissez la matrice se solidifier.</li>
		<li>Une fois la matrice solidifiée, couvrez doucement la calvaire avec le lambeau de peau pour vous assurer que le tissu ne se déshydrate pas. Incuber pendant 1 h avant l’imagerie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Imagerie intravitale
<ol><li>Paramètres du microscope<ol>
<li>Allumez le laser multiphoton (laser titane-saphir femtoseconde). Réglez la longueur d’onde sur 880 nm et ajustez la puissance pour l’imagerie de deuxième génération harmonique (SHG) (440 nm) de l’os.</li>
		<li>Allumez les lasers à semi-conducteurs 488 nm et 561 nm pour l’excitation des cellules exprimant GFP et tdTomato, respectivement.</li>
		<li>Allumez les détecteurs PMT (tube photomultiplicateur) pour la deuxième génération d’harmoniques (détection 405-455 nm) et GFP (détection 505-550 nm). Activez le détecteur HyD 3 pour le signal de la tomate (détection 590-620 nm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montage<ol>
<li>Avant de déplacer la souris vers la lunette, vérifiez le plan visuel de la calvaire en appuyant doucement sur l’arrière de la tête de la souris. Si le plan n’est pas de niveau, ajustez la position en faisant pivoter doucement le dispositif de retenue de la souris vers la gauche ou la droite. REMARQUE: Il s’agit d’une étape critique pour garantir une qualité d’image suffisante.</li>
		<li>Appliquer de la méthylcellulose stérile à 2 % dans l’eau (p/v) pour couvrir toute la calvaire et le lambeau de peau et éviter le dessèchement des tissus.</li>
		<li>Placez la souris sur l’étage du microscope motorisé à axe XYZ (Figure 1G). En utilisant la lumière épifluorescente, alignez la souris de sorte que 1) elle soit orientée vers le microscope et 2) l’intersection des sutures coronales et sagittales soit le point de référence centré de la scène.</li>
		<li>Placez le couvercle en verre sur la zone d’imagerie et vérifiez l’alignement (Figure 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagerie time-lapse<ol>
<li>Utilisez une lentille à faible grossissement (objectif d’immersion dans l’eau 25x avec NA = 0,95) pour scanner la calvaire. Acquérir une image de référence de l’intersection de la suture sagittale et coronale.</li>
		<li>À l’aide du SHG et des signaux fluorescents des cellules, localisez chaque vue de blessure et enregistrez les coordonnées XYZ ainsi que les distances des sutures sagittales et coronales (Figure 2B).</li>
		<li>Choisissez un emplacement sur les sutures coronales ou sagittales pour l’imagerie à long terme. Prenez une image détaillée de la pile Z de cette zone à partir de la référence pendant l’imagerie. REMARQUE: Étant donné que les sutures représentent une niche P-SSC connue, c’est de là que les cellules migreront en réponse à la lésion de la calvaire.</li>
		<li>Utilisez les paramètres du logiciel time-lapse pour enregistrer une image toutes les 1 min pendant au moins 1 h. Entre les instantanés, comparez le champ de vision actuel avec le champ de vision initial. S’ils sont différents, utilisez l’image Z-stack pour déterminer dans quelle direction le champ de vision doit être ajusté.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Soins postopératoires aux animaux
<ol><li>Après imagerie, rincer la calvaire exposée avec du PBS stérile pour éliminer la méthylcellulose.</li>
	<li>Pour fermer l’incision, placez doucement le lambeau de peau sur la calvaire. Utilisez des cotons-tiges stériles pour enlever la pommade ophtalmique résiduelle et sécher le site d’incision.</li>
	<li>À l’aide de sutures non absorbables en nylon monofilament de taille 5-0 avec une aiguille de coupe inversée C-1 attachée, fermez le site chirurgical. Utilisez un coton-tige stérile pour appliquer une pommade antibiotique triple sur l’incision fermée. REMARQUE: Les cicatrices sont réduites avec des techniques de suture de haute qualité et un saignement minimal.</li>
	<li>Placez la souris dans une cage propre sur une surface chaude et vérifiez toutes les 15 minutes jusqu’à ce que la position couchée sternale soit atteinte.</li>
	<li>Administrer une deuxième dose de buprénorphine à libération prolongée 72 h après la chirurgie.</li>
	<li>Surveillez quotidiennement le comportement de câlin, la fourrure ébouriffée et / ou le manque de déambulation jusqu’à ce que les sutures soient retirées (~ 1 semaine).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+mechanisms+and+interventions.">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li><li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture.">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li><li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration.">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li><li>Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+periosteum+for+skeletal+regeneration:+the+stem+cell+that+lies+beneath.">Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath.</a> Bone. 70, 10-18 (2015).</li><li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin.">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).</li><li>Olivos-Meza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+of+periosteum+with+TGF-beta1+in+situ+enhances+the+quality+of+osteochondral+tissue+regenerated+from+transplanted+periosteal+grafts+in+adult+rabbits.">Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).</li><li>Debnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+periosteal+stem+cell+mediating+intramembranous+bone+formation.">Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation.</a> Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).</li><li>Ransom, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axin2-expressing+cells+execute+regeneration+after+skeletal+injury.">Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury.</a> Scientific Reports. 6, 36524 (2016).</li><li>Ouyang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prx1+and+3.2kb+Col1a1+promoters+target+distinct+bone+cell+populations+in+transgenic+mice.">Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice.</a> Bone. 58, 136-145 (2013).</li><li>Wilk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Calvarial+Skeletal+Stem+Cells+Expressing+PRX1+Reside+Exclusively+in+the+Calvarial+Sutures+and+Are+Required+for+Bone+Regeneration.">Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).</li><li>Ortinau, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Functionally+Distinct+Mx1+alphaSMA++Periosteal+Skeletal+Stem+Cells.">Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).</li><li>Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+gene+expression+identifies+distinct+molecular+signatures+of+bone+marrow-+and+periosteal-skeletal+stem/progenitor+cells.">Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).</li><li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+during+fracture+repair:+The+cellular+picture.">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+identifies+osteogenic+progenitors+for+bone+formation+and+fracture+repair.">Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).</li><li>Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin-receptor-expressing+mesenchymal+stromal+cells+represent+the+main+source+of+bone+formed+by+adult+bone+marrow.">Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).</li><li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells.">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+marrow+MSCs+are+dynamic,+fate-restricted+participants+in+bone+maintenance+and+regeneration.">Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).</li><li>Nitzsche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+MSC+Adhesion+Cascade-Insights+into+Homing+and+Transendothelial+Migration.">Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration.</a> Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).</li><li>Adler, J., Pagakis, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+image+distortions+due+to+temperature-related+microscope+stage+drift.">Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift.</a> Journal of Microscopy. 210, 131-137 (2003).</li><li>Roberts, S. J., Ke, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anabolic+Strategies+to+Augment+Bone+Fracture+Healing.">Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing.</a> Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).</li></ol>

L.C.O. et D.P. divulguent un brevet en instance intitulé « Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair » (BAYM. P0264US. P1). Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Au cours de la cicatrisation osseuse, les cellules périostées sont la principale source de chondrocytes et d’ostéoblastes nouvellement différenciés dans un callosité de blessure3. À l’instar de la moelle osseuse, des SSC ostéogéniques/chondrogènes ont également été identifiés dans le périoste4,5,6. L’évaluation des caractéristiques fonctionnelles endogènes du P-SSC est techniquemen...

La réparation des fractures est un processus dynamique et multicellulaire qui se distingue du développement et du remodelage du squelette embryonnaire. Au cours de ce processus, l’induction de signaux de blessure provenant de tissus endommagés est suivie du recrutement, de la prolifération et de la différenciation subséquente des cellules souches/progénitrices squelettiques, qui sont toutes essentielles à la stabilité globale et à la fixation des fractures1. En particulier, les premiers stades de la guérison des fractures nécessitent la formation de callosités molles, qui est principalement attribuée aux cellules résidentes périostées2. Lorsque les os sont blessés, un sous-ensemble de cellules périostées réagit rapidement et contribue à de nouveaux intermédiaires cartilagineux et ostéoblastes dans le callosité3, impliquant la présence d’une population distincte de cellules souches squelettiques / progénitrices dans le périoste. Par conséquent, l’identification et la caractérisation fonctionnelle des cellules souches squelettiques (CSE) résidentes du périoste constituent une approche thérapeutique prometteuse pour les maladies osseuses dégénératives et les défauts osseux4.
On pense que les SSC résident dans plusieurs emplacements tissulaires, y compris la moelle osseuse. À l’instar de la moelle osseuse, des SSC ostéogéniques/chondrogènes ont également été identifiés dans le périoste4,5,6.  Ces SSC périostés (P-SSC) peuvent être marqués avec des marqueurs de lignée mésenchymateuse précoce (c.-à-d. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 et Axin2-CreER8) au cours du développement osseux du fœtus4,7,8,9,10. Une limitation importante de ces modèles de traçage de lignée génétique unique est qu’il existe une hétérogénéité substantielle au sein des populations cellulaires marquées. De plus, ils ne peuvent pas distinguer les SSC étiquetés de leur progéniture in vivo. Pour remédier à cette limitation, nous avons récemment développé une souris rapporteur double (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) pour visualiser distinctement les P-SSC des SSC de moelle osseuse (BM-SSCs)11. Avec ce modèle, il a été déterminé que les P-SSC sont marqués par un double marquage Mx1+αSMA+, tandis que les cellules Mx1+ plus différenciées résident dans la moelle osseuse, les surfaces endostéale et périostéale, ainsi que dans les os corticaux et trabéculaires11,12.
De multiples cytokines et facteurs de croissance sont connus pour réguler le remodelage et la réparation des os et ont été testés pour l’amélioration de la réparation squelettique dans les défauts critiques du segment1,13. Cependant, en raison de la complexité cellulaire des modèles de blessures générés par la perturbation de la barrière physique du compartiment osseux, les effets directs de ces molécules sur la migration et l’activation endogènes de P-SSC pendant la guérison ne sont pas clairs. Les caractéristiques fonctionnelles et la dynamique migratoire des SSC sont souvent évaluées in vitro en effectuant un test de transpuit ou de grattage, en combinaison avec des cytokines ou des facteurs de croissance connus pour induire la migration dans d’autres populations cellulaires. Ainsi, l’interprétation des résultats de ces expériences in vitro pour une application dans leurs systèmes in vivo correspondants est difficile. À l’heure actuelle, l’évaluation in vivo de la migration des cellules souches/progénitrices squelettiques n’est généralement pas observée en temps réel; il est plutôt mesuré à des points temporels fixes après la fracture5,7,14,15,16.
Une limite de cette méthode est que la migration n’est pas évaluée au niveau d’une seule cellule; il est plutôt mesuré par des changements dans les populations cellulaires. Grâce aux progrès récents de la microscopie intravitale d’animaux vivants et à la génération de souris rapporteures supplémentaires, le suivi in vivo de cellules individuelles est désormais possible. En utilisant la microscopie intravitale d’animaux vivants, nous avons observé la migration distincte des P-SSC de la niche de suture calvariaire vers une lésion osseuse dans les 24 à 48 heures suivant la blessure chez les souris Mx1 / Tomato / αSMA-GFP.
CCL5/CCR5 a récemment été identifié comme un mécanisme de réglementation influençant le recrutement et l’activation des P-SSC au cours de l’intervention précoce en cas de blessure. Fait intéressant, il n’y a pas eu de détection en temps réel d’une migration importante de P-SSC en réponse à une blessure. Cependant, le traitement d’une blessure avec CCL5 produit une migration robuste et directionnelle distincte des P-SSC, qui peut être capturée en temps réel. Par conséquent, l’objectif de ce protocole est de fournir une méthodologie détaillée pour enregistrer la migration in vivo des P-SSC en temps réel après le traitement par CCL5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="719">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">&#189;&#8221; optical post</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:135px;">TR2</td>
			<td style="width:247px;">For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">27G needle</td>
			<td style="width:175px;">BD PercisionGlide</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">29G insulin syringe</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>102-SN05C905P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">50 mL conicol tube</td>
			<td style="width:175px;">Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>For mouse restraint</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Adjustable angle plate</td>
			<td style="width:175px;">Renishaw</td>
			<td>R-PCA-5023-50-20</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:175px;">Coviden</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">betadine surgical scrub</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Buprenorphine SR-LAB</td>
			<td style="width:175px;">ZooPharm</td>
			<td></td>
			<td>1mg/mL Sustained Release</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Combo III</td>
			<td style="width:175px;">Obtained from staff veterinarian</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:247px;">37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Coverslip</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td>24 x 40 premium superslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Fine tip forcepts</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Ketamine</td>
			<td style="width:175px;">KetaVed</td>
			<td>50989-161-06</td>
			<td style="width:247px;">100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td>
			<td style="width:175px;">Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Matrigel</td>
			<td style="width:175px;">R &#38; D Systems</td>
			<td>344500101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:164px;">Medical tape</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>100199</td>
			<td>3&#34; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Methocellulose</td>
			<td style="width:175px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Microdissection scissors</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>1456-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:175px;">Anaheim automation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Needle holder</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Nonabsorbable sutures</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>S913BX</td>
			<td style="width:247px;">monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Rugby</td>
			<td>0536-1086-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">RANTES</td>
			<td style="width:175px;">Biolegend</td>
			<td>594202</td>
			<td>10 &#181;g/50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Right-angle clamp for &#189;&#8221; post, 3/16&#8221; Hex</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Spring-loaded 3/16&#8221; Hex-locking &#188;&#8221; thumbscrew</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>TS25H</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile cotton swabs</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>100-9249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile DPBS (1x)</td>
			<td style="width:175px;">Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:164px;">Sterile drapes</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>25-517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Surgical gloves</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>3158VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Triple antibiotic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td>
			<td>51672-2120-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">REF 367298</td>
			<td style="width:247px;">25G butterfly needle infusion set with 12&#34; tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

Les cellules souches squelettiques périostées (P-SSC) sont essentielles à l’entretien et à la réparation des os tout au long de leur vie, ce qui en fait un point de mire idéal pour le développement de thérapies visant à améliorer la guérison des fractures.  Les cellules périostées migrent rapidement vers une blessure pour fournir de nouveaux chondrocytes et ostéoblastes pour la guérison des fractures. Traditionnellement, l’efficacité d’une cytokine pour induire la migration cellulaire n’a été réalisée in vitro qu’en effectuant un test transwell ou scratch. Avec les progrès de la microscopie intravitale utilisant l’excitation multiphotonique, il a été récemment découvert que 1) les P-SSC expriment le gène migrateur CCR5 et 2) le traitement avec le ligand CCR5 connu sous le nom de CCL5 améliore la cicatrisation des fractures et la migration des P-SSC en réponse à CCL5. Ces résultats ont été saisis en temps réel. Décrit ici est un protocole pour visualiser la migration de la P-SSC de la niche des cellules souches squelettiques (SSC) de suture calvariaire vers une blessure après un traitement par CCL5. Le protocole détaille la construction d’une fixation de souris et d’un support d’imagerie, la préparation chirurgicale de la calvaire de la souris, l’induction d’un défaut de calvaire et l’acquisition de l’imagerie en accéléré.

Il a été proposé que les progéniteurs squelettiques aient un potentiel migratoire ou circulatoire20. Récemment, des souris rapporteures Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) ont été générées, dans lesquelles les P-SSC sont marquées par un double marquage Mx1+α SMA+ (Figure 2A,B). Une migration importante ...

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Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Ce protocole décrit la détection de la migration des cellules souches squelettiques périostées médiées par CCL5 en temps réel à l’aide de la microscopie intravitale d’animaux vivants.

Imagerie en temps réel de la migration induite par CCL5 de cellules souches squelettiques périostées chez la souris

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K vues.  Baylor College of Medicine. Ce protocole décrit la détection de la migration des cellules souches squelettiques périostées médiées par CCL5 en temps réel à l’aide de la microscopie intravitale d’animaux vivants.

Vidéo: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Recherche

Biologie du développement

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et d&#39;imagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Évaluation des lésions induites par la sénescence et In Vivo reprogrammation dans le Muscle squelettique

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Analyse de calcul de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans pour étudier la Distribution des noyaux, les protéines et le cytosquelette

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Évaluation des dommages oxydatifs dans les cellules de surface oculaires de la souris primaire/cellules souches en réponse aux dommages causés par les ultraviolets-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Exécution des xénogreffes de muscle squelettique humain dans les souris immunodéficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...