Este trabajo fue apoyado por el Bone Disease Program of Texas Award, el Caroline Wiess Law Fund Award y el NIAMS de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 a D.P.  Agradecemos a M.E. Dickinson y T.J. Vadakkan en el BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core y bcM Advanced Technology Cores con fondos de NIH (AI036211, CA125123 y DK056338).
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Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Baylor College of Medicine.
1. Preparación del ratón
<ol><li>Cruce los ratones Mx1-Cre17 y Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 (comprados en el Laboratorio Jackson) con ratones αSMA-GFP (proporcionados aquí por los doctores Ivo Kalajzic y Henry Kronenberg) para generar ratones reporteros Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) (Figura 2A).</li>
	<li>Para la inducción de Mx1-Cre, inyecte a los ratones 25 mg/kg de pIpC cada dos días durante 10 días.</li>
	<li>Irradiar ratones con 9,5 Gy 1 día antes del trasplante intravenoso de 1 x 106 células mononucleares de médula ósea entera de ratones C57BL/6 de tipo salvaje (WT-BMT)19.</li>
	<li>Después de 6 a 8 semanas de recuperación, someta a los ratones a las imágenes in vivo del protocolo de migración de células periósticas que se describen a continuación. NOTA: La irradiación y el WT-BMT de ratones Mx1-Cre son necesarios para eliminar endógenamente las células hematopoyéticas marcadas con Mx1 que pueden responder a una lesión. De seis a ocho semanas después de la irradiación, el recuento de células hematopoyéticas del huésped está en <5% y, por lo tanto, listo para la obtención de imágenes19.</li>
</ol>2. Sujeción del ratón y montaje de imágenes
<ol><li>Cree una sujeción del ratón con un tubo cónico de 50 ml (Figura 1A).<ol>
<li>Usando tijeras puntiagudas, haga un agujero a través de la parte inferior de la cónica. Corte desde el orificio inferior hasta la parte superior de la cónica (el lado cortado será la parte superior de la sujeción).</li>
		<li>Haga un corte de aproximadamente 4-5 cm de largo paralelo al corte anterior y hasta la mitad (~ 2 cm) de la parte superior de la sujeción. Quitar esta sección de la cónica y lisar los bordes eran necesarios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construya un soporte de imagen de tubo cónico utilizando una placa de ángulo ajustable, un poste óptico de 0.5" y una abrazadera de ángulo recto para el poste de 0.5" Hex de 0.1875" (Figura 1B y Tabla de Materiales).<ol>
<li>Ajuste la placa angular a un ángulo de 35°. En el lado izquierdo de la placa angular, atornille el poste óptico en el segundo orificio desde la parte posterior de la placa.</li>
		<li>En el lado derecho de la placa ajustable, inserte un tornillo de pulgar de 0.25" con bloqueo hexagonal de 0.1875" cargado por resorte en el segundo orificio desde el frente y el último orificio de la placa. La abrazadera de ángulo recto se utilizará con el poste óptico para asegurar la sujeción cónica del ratón en su lugar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procedimiento quirúrgico preoperatorio
<ol><li>Anestesia de ratón<ol>
<li>Para el manejo del dolor, inyecte subcutáneamente al ratón buprenorfina de liberación sostenida (1 mg/kg de peso corporal) 30-60 minutos antes de la cirugía.</li>
		<li>Anestesiar ratones utilizando anestesia combinada de CCM de roedor III (combo III) que contiene 37,5 mg/ml de ketamina, 1,9 mg/ml de xilazina y 0,37 mg/ml de acepromazina. La dosis adecuada para ratones es de 0,75 a 1,50 ml por 1 kg de peso corporal. La dosis durará de 30 a 45 minutos.</li>
		<li>Una vez que el ratón esté anestesiado, aplique ungüento oftálmico en los ojos con un hisopo de algodón estéril para prevenir la deshidratación ocular.</li>
		<li>Para imágenes a largo plazo (>45 min), administre anestesia nuevamente para mantener la profundidad anestésica adecuada de la siguiente manera.<ol>
<li>Prepare una jeringa de 1 ml con una cantidad suficiente de combo III para mantener la anestesia durante la duración planificada de la imagen (0,75 ml/kg de peso corporal por 30 minutos de sedación adicional). Conecte un juego de infusión de aguja de mariposa de 25 G con tubo de 12"a la jeringa y empuje el anestésico a través del tubo y la aguja.</li>
			<li>Inserte la aguja de mariposa por vía intraperitoneal y, a continuación, coloque la aguja con cinta adhesiva en su lugar. NOTA: Así es como se administrará el combo III adicional durante la toma de imágenes, de modo que no haya necesidad de mover al animal o interrumpir el plano de visión.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Proporcione soporte térmico con una almohadilla térmica mantenida a 37 ° C durante todo el procedimiento. Para imágenes prolongadas (>1 hora) será necesario un soporte adicional de líquido.  Se pueden proporcionar líquidos suplementarios I.P. con Combo III adicional durante la toma de imágenes o 33 ml / kg de solución salina (0.9 NaCl) por vía subcutánea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sujeción del ratón y preparación del sitio quirúrgico<ol>
<li>Use cortapelos para eliminar la mayor cantidad de vello posible de la parte superior de la cabeza. Aplique crema depilatoria en el área afeitada para eliminar el vello restante en el sitio quirúrgico.</li>
		<li>Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado por la falta de respuesta a los pellizcos de los dedos de los pies. Después de 15 min, si el ratón no está completamente anestesiado, administre una segunda dosis más pequeña de combo III (<0,75 ml/kg de peso corporal).</li>
		<li>Coloque el ratón en la cola de sujeción primero, deslizándolo lo suficientemente hacia atrás como para que la nariz cuelgue ligeramente sobre el borde de la cónica.</li>
		<li>Pega las patas delanteras con cinta adhesiva a la parte inferior del tubo cónico con cinta médica.</li>
		<li>Coloque el tubo cónico con el ratón en un soporte de imagen que se ajuste en un ángulo de 35 ° y se asegure con la abrazadera de ángulo recto (Figura 1C).</li>
		<li>Una vez que el ratón esté seguro en el soporte de imágenes, limpie el sitio quirúrgico 3 veces con exfoliantes alternos de exfoliante de betadina y alcohol isopropílico al 70%. Nuevamente, verifique que el animal esté completamente sedado.</li>
		<li>Mueva el ratón a una almohadilla absorbente limpia y coloque una cortina sobre el ratón para crear un gran campo estéril.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Procedimiento quirúrgico
<ol><li>Incisión de apertura<ol>
<li>Usando pinzas de punta fina, recoja la piel inmediatamente medial hasta la oreja derecha. Con tijeras de microdisección, corte la piel sujeta por las pinzas. NOTA: Iniciar la incisión utilizando el método descrito anteriormente crea una incisión redondeada que es más adecuada para suturar después del procedimiento.</li>
		<li>Haga una incisión transversal a partir de la incisión inicial hacia el oído izquierdo (<1 cm).  Haga otra incisión, a partir de la incisión inicial, hacia la nariz del animal (~ 2-3 mm más allá del ojo derecho).</li>
		<li>Separe la piel del periostio usando las pinzas y las tijeras para cortar suavemente el tejido conectivo que separa la piel del calvario periostio.</li>
		<li>Usando un hisopo de algodón estéril, aplique un poco de ungüento oftálmico en la parte superior del colgajo de la piel.  Tome suavemente el colgajo de la piel y dóblelo sobre el ojo izquierdo. La intersección de las suturas sagital y coronal debe estar claramente expuesta (Figura 1E). NOTA: El ungüento oftálmico se usa para mantener el colgajo de la piel en su lugar.</li>
		<li>Enjuague la superficie abierta con PBS estéril para limpiar el área de cualquier sangre y cabello residual. NOTA: Si es necesario, use pinzas de punta fina para eliminar los pelos que quedan después del enrojecimiento, pero tenga cuidado de no dañar el periostio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microfractura<ol>
<li>Para generar microfracturas en la calvaria, retire el émbolo de una jeringa de insulina de 29 G y corte el extremo posterior de la jeringa, alrededor de las marcas de 300-400 uL. NOTA: Este paso hace que sea más fácil maniobrar bajo un endoscopio de disección al producir la lesión.</li>
		<li>Coloque la punta de un bisel (uno o dos anchos de aguja) hacia la nariz desde la sutura coronal y uno o dos anchos de aguja a la derecha de la sutura sagital (Figura 1E).</li>
		<li>Gire suavemente la jeringa en el sentido de las agujas del reloj, luego en sentido contrario a las agujas del reloj varias veces. NOTA: En ratones jóvenes, se necesita una cantidad muy pequeña de presión hacia abajo para crear una microfractura circular. Tenga cuidado de no dejar que la aguja penetre en el cerebro, ya que esto causará sangrado e interferirá con las imágenes.</li>
		<li>Use una aguja de 27 G para ensanchar la microfractura a ~ 0.4 mm. Si quedan fragmentos de hueso en la microfractura, enjuague el área con PBS. Si los fragmentos de hueso aún permanecen en la microfractura, use la aguja de 29 G para sacarlos suavemente.</li>
		<li>Repita los pasos 4.2.1–4.2.4 para crear una lesión en el lado izquierdo de la sutura sagital. NOTA: En este punto, hay dos opciones: 1) proceder inmediatamente al tratamiento con CCL5 (sección 4.3) y a la obtención de imágenes (sección 5); o 2) cerrar el sitio quirúrgico después de los procedimientos postoperatorios de la sección 6. A las 24 h posteriores, anestesiar de nuevo al ratón, reabrir la vista quirúrgica, tratar la lesión con CCL5 (sección 4.3) y realizar imágenes intravitales (sección 5) y cuidados postoperatorios (sección 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tratamiento CCL5<ol>
<li>A partir de un stock de RANTES (100 ng/mL), hacer una solución de 10 ng/mL utilizando la matriz de membrana basal (Tabla de Materiales). Mantenga esta solución en hielo para mantener la matriz en forma líquida.</li>
		<li>Trate cada lesión con 2 μL de CCL5 (10 ng/μL) utilizando una pipeta de 2-20 μL (esta punta de pipeta tiene un diámetro mayor, que es más efectivo cuando se usa un líquido viscoso). Permita que la matriz se solidifique.</li>
		<li>Una vez que la matriz se haya solidificado, cubra suavemente la calvaria con el colgajo de la piel para asegurarse de que el tejido no se deshidrate. Incubar durante 1 h antes de la toma de imágenes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Imágenes intravitales
<ol><li>Ajustes del microscopio<ol>
<li>Encienda el láser multifotón (láser de titanio-zafiro de femtosegundo). Ajuste la longitud de onda a 880 nm y ajuste la potencia para obtener imágenes de segunda generación armónica (SHG) (440 nm) del hueso.</li>
		<li>Encienda los láseres de estado sólido de 488 nm y 561 nm para la excitación de las células que expresan GFP y tdTomato, respectivamente.</li>
		<li>Encienda los detectores PMT (tubo fotomultiplicador) para señales de segunda generación armónica (detección de 405–455 nm) y GFP (detección de 505–550 nm). Encienda el detector HyD 3 para la señal de tomate (detección de 590–620 nm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montura<ol>
<li>Antes de mover el ratón al endoscopio, compruebe el plano visual de la calvaria presionando suavemente la parte posterior de la cabeza del ratón. Si el plano no está nivelado, ajuste la posición girando suavemente la sujeción del ratón hacia la izquierda o la derecha. NOTA: Este es un paso crítico para garantizar una calidad de imagen suficiente.</li>
		<li>Aplique metilcelulosa estéril al 2% en agua (p/v) para cubrir toda la calvaria y el colgajo de la piel y evitar el secado del tejido.</li>
		<li>Coloque el ratón en la etapa de microscopio motorizado del eje XYZ (Figura 1G). Usando la luz epifluorescente, alinee el ratón de modo que 1) esté mirando hacia el microscopio y 2) la intersección de las suturas coronal y sagital sea el punto de referencia centrado de la etapa.</li>
		<li>Coloque la cubierta de vidrio en el área de imágenes y verifique la alineación (Figura 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imágenes de lapso de tiempo<ol>
<li>Use una lente de bajo aumento (objetivo de inmersión en agua 25x con NA = 0.95) para escanear la calvaria. Adquirir una imagen de referencia de la intersección de sutura sagital y coronal.</li>
		<li>Utilizando las señales SHG y fluorescentes de las células, localice cada vista de lesión y registre las coordenadas XYZ, así como las distancias de las suturas sagital y coronal (Figura 2B).</li>
		<li>Elija una ubicación en las suturas coronales o sagitales para obtener imágenes a largo plazo. Tome una imagen detallada de la pila Z de esta área de referencia durante la toma de imágenes. NOTA: Dado que las suturas representan un nicho conocido de P-SSC, aquí es donde las células migrarán en respuesta a la lesión de la calvaria.</li>
		<li>Utilice la configuración del software de lapso de tiempo para grabar una imagen cada 1 minuto durante al menos 1 h. En el tiempo transcurrido entre instantáneas, compare el campo de visión actual con el campo de visión inicial. Si son diferentes, utilice la imagen de la pila Z para determinar en qué dirección debe ajustarse el campo de visión.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Cuidado postoperatorio de animales
<ol><li>Después de la toma de imágenes, enjuague la calvaria expuesta con PBS estéril para eliminar la metilcelulosa.</li>
	<li>Para cerrar la incisión, coloque suavemente el colgajo de piel sobre la calvaria. Use hisopos de algodón estériles para eliminar el ungüento oftálmico residual y secar el sitio de la incisión.</li>
	<li>Usando suturas no absorbibles de nylon monofilamento de tamaño 5-0 con una aguja de corte inversa C-1 adjunta, cierre el sitio quirúrgico. Use un hisopo de algodón estéril para aplicar ungüento antibiótico triple a la incisión cerrada. NOTA: La cicatrización se reduce con técnicas de sutura de alta calidad y sangrado mínimo.</li>
	<li>Coloque el ratón en una jaula limpia sobre una superficie cálida y verifique cada 15 minutos hasta que se logre la reclinación esternal.</li>
	<li>Administrar una segunda dosis de buprenorfina de liberación sostenida 72 h después de la cirugía.</li>
	<li>Controle diariamente el comportamiento de acurrucamiento, el pelaje con volantes y / o la falta de deambulación hasta que se retiren las suturas (~ 1 semana).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+mechanisms+and+interventions.">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li><li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture.">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li><li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration.">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li><li>Roberts, S. 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L.C.O. y D.P. divulgan una patente pendiente titulada "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). Los autores restantes no declaran intereses contrapuestos.

Durante la cicatrización ósea, las células periósticas son la principal fuente de condrocitos y osteoblastos recién diferenciados dentro de un callo lesionado3. Al igual que en la médula ósea, también se han identificado CSS osteogénicas/condrogénicas en el periostio4,5,6. La evaluación de las características funcionales endógenas de P-SSC es técnicamente un desafío. A menudo, la dinámica ...

La reparación de fracturas es un proceso dinámico y multicelular que es distinto del desarrollo y la remodelación del esqueleto embrionario. Durante este proceso, la inducción de señales de lesión del tejido dañado es seguida por el rápido reclutamiento, proliferación y posterior diferenciación de las células madre/progenitoras esqueléticas, que son críticas para la estabilidad general y la fijación de las fracturas1. En particular, las primeras etapas de la cicatrización de la fractura requieren la formación de callos blandos, que se atribuye principalmente a las células residentes del periostio2. Cuando los huesos se lesionan, un subconjunto de células periósticas responden rápidamente y contribuyen a los intermedios de cartílago y osteoblastos recién diferenciados dentro del callo3, lo que implica la presencia de una población distinta de células madre/progenitoras esqueléticas dentro del periostio. Por lo tanto, la identificación y caracterización funcional de las células madre esqueléticas residentes en el periostio (CSS) constituyen un enfoque terapéutico prometedor para las enfermedades óseas degenerativas y los defectos óseos4.
Se cree que las SSC residen en múltiples ubicaciones de tejidos, incluida la médula ósea. Al igual que en la médula ósea, también se han identificado CSS osteogénicas/condrogénicas en el periostio4,5,6.  Estas SSCs periósticas (P-SSCs) se pueden etiquetar con marcadores de linaje mesenquimal temprano (es decir, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 y Axin2-CreER8) durante el desarrollo óseo fetal4,7,8,9,10. Una limitación significativa de estos modelos de rastreo de linaje genético único es que existe una heterogeneidad sustancial dentro de las poblaciones celulares marcadas. Además, no pueden distinguir las CSS etiquetadas de su progenie in vivo. Para abordar esta limitación, recientemente desarrollamos un ratón reportero dual (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) para visualizar claramente las P-SSCs de las SSCs de médula ósea (BM-SSCs)11. Con este modelo, se ha determinado que las P-SSC están marcadas por el etiquetado dual Mx1+αSMA+, mientras que las células Mx1+ más diferenciadas residen en la médula ósea, las superficies endodesteal y perióstica, y los huesos corticales y trabeculares11,12.
Se sabe que múltiples citoquinas y factores de crecimiento regulan la remodelación y reparación ósea y han sido probados para la mejora de la reparación esquelética en defectos críticos del segmento1,13. Sin embargo, debido a la complejidad celular de los modelos de lesión generados a través de la interrupción de la barrera física del compartimento óseo, los efectos directos de estas moléculas sobre la migración endógena de P-SSC y la activación durante la curación no están claros. Las características funcionales y la dinámica migratoria de las CSS a menudo se evalúan in vitro mediante la realización de un ensayo de transpozo o rasguño, en combinación con citoquinas o factores de crecimiento que se sabe que inducen la migración en otras poblaciones celulares. Por lo tanto, la interpretación de los resultados de estos experimentos in vitro para su aplicación en sus correspondientes sistemas in vivo es un desafío. Actualmente, la evaluación in vivo de la migración de células madre/progenitoras esqueléticas no se observa típicamente en tiempo real; más bien, se mide en puntos de tiempo fijos después de la fractura5,7,14,15,16.
Una limitación de este método es que la migración no se evalúa a nivel de una sola célula; más bien, se mide a través de cambios en las poblaciones celulares. Debido a los recientes avances en la microscopía intravital de animales vivos y la generación de ratones reporteros adicionales, ahora es posible el seguimiento in vivo de células individuales. Utilizando microscopía intravital de animales vivos, observamos la migración distinta de P-SSCs desde el nicho de sutura de calvaria a una lesión ósea dentro de las 24-48 h posteriores a la lesión en ratones Mx1 / Tomate / αSMA-GFP.
CCL5/CCR5 se identificó recientemente como un mecanismo regulador que influye en el reclutamiento y la activación de P-SSCs durante la respuesta temprana a la lesión. Curiosamente, no hubo detección de una migración sustancial de P-SSC en respuesta a una lesión en tiempo real. Sin embargo, el tratamiento de una lesión con CCL5 produce una migración robusta y direccionalmente distinta de P-SSC, que se puede capturar en tiempo real. Por lo tanto, el objetivo de este protocolo es proporcionar una metodología detallada para registrar la migración in vivo de P-SSC en tiempo real después del tratamiento con CCL5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="719">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">&#189;&#8221; optical post</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:135px;">TR2</td>
			<td style="width:247px;">For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">27G needle</td>
			<td style="width:175px;">BD PercisionGlide</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">29G insulin syringe</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>102-SN05C905P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">50 mL conicol tube</td>
			<td style="width:175px;">Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>For mouse restraint</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Adjustable angle plate</td>
			<td style="width:175px;">Renishaw</td>
			<td>R-PCA-5023-50-20</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:175px;">Coviden</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">betadine surgical scrub</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Buprenorphine SR-LAB</td>
			<td style="width:175px;">ZooPharm</td>
			<td></td>
			<td>1mg/mL Sustained Release</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Combo III</td>
			<td style="width:175px;">Obtained from staff veterinarian</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:247px;">37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Coverslip</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td>24 x 40 premium superslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Fine tip forcepts</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Ketamine</td>
			<td style="width:175px;">KetaVed</td>
			<td>50989-161-06</td>
			<td style="width:247px;">100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td>
			<td style="width:175px;">Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Matrigel</td>
			<td style="width:175px;">R &#38; D Systems</td>
			<td>344500101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:164px;">Medical tape</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>100199</td>
			<td>3&#34; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Methocellulose</td>
			<td style="width:175px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Microdissection scissors</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>1456-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:175px;">Anaheim automation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Needle holder</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Nonabsorbable sutures</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>S913BX</td>
			<td style="width:247px;">monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Rugby</td>
			<td>0536-1086-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">RANTES</td>
			<td style="width:175px;">Biolegend</td>
			<td>594202</td>
			<td>10 &#181;g/50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Right-angle clamp for &#189;&#8221; post, 3/16&#8221; Hex</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Spring-loaded 3/16&#8221; Hex-locking &#188;&#8221; thumbscrew</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>TS25H</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile cotton swabs</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>100-9249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile DPBS (1x)</td>
			<td style="width:175px;">Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:164px;">Sterile drapes</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>25-517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Surgical gloves</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>3158VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Triple antibiotic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td>
			<td>51672-2120-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">REF 367298</td>
			<td style="width:247px;">25G butterfly needle infusion set with 12&#34; tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

Las células madre esqueléticas periósticas (P-SSC) son esenciales para el mantenimiento y la reparación ósea de por vida, lo que las convierte en un foco ideal para el desarrollo de terapias para mejorar la curación de fracturas.  Las células periósticas migran rápidamente a una lesión para suministrar nuevos condrocitos y osteoblastos para la curación de fracturas. Tradicionalmente, la eficacia de una citoquina para inducir la migración celular solo se ha llevado a cabo in vitro mediante la realización de un ensayo de transpozo o rasguño. Con los avances en la microscopía intravital utilizando excitación multifotónica, recientemente se descubrió que 1) las P-SSC expresan el gen migratorio CCR5 y 2) el tratamiento con el ligando CCR5 conocido como CCL5 mejora la cicatrización de fracturas y la migración de P-SSCs en respuesta a CCL5. Estos resultados han sido capturados en tiempo real. Aquí se describe un protocolo para visualizar la migración de P-SSC desde el nicho de células madre esqueléticas (SSC) de sutura calvarial hacia una lesión después del tratamiento con CCL5. El protocolo detalla la construcción de una sujeción del ratón y un soporte de imágenes, la preparación quirúrgica de la calvaria del ratón, la inducción de un defecto de la calvaria y la adquisición de imágenes de lapso de tiempo.

Se ha propuesto que los progenitores esqueléticos tienen potencial migratorio o circulatorio20. Recientemente, se generaron ratones reporteros Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), en los que los P-SSC están marcados por el etiquetado dual Mx1+α SMA+ (Figura 2A,B). La migración sustancial de Mx1+</...

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Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Este protocolo describe la detección de la migración de células madre esqueléticas periósticas mediada por CCL5 en tiempo real utilizando microscopía intravital de animales vivos.

Imágenes en tiempo real de la migración inducida por CCL5 de células madre esqueléticas periósticas en ratones

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K vistas.  Baylor College of Medicine. Este protocolo describe la detección de la migración de células madre esqueléticas periósticas mediada por CCL5 en tiempo real utilizando microscopía intravital de animales vivos.

Video: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Evaluación del daño oxidativo en las células madre primarias del ratón/células madre en respuesta al daño ultravioleta-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Realización de Xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...