Bu çalışma Teksas Kemik Hastalıkları Programı Ödülü, Caroline Wiess Hukuk Fonu Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri NIAMS tarafından R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 to D.P.  BCM Optik Görüntüleme ve Vital Mikroskopi Çekirdeği'ndeki M.E. Dickinson ve T.J. Vadakkan'a ve NIH (AI036211, CA125123 ve DK056338) fonlarıyla BCM İleri Teknoloji Çekirdeklerine teşekkür ederiz.
.

Tüm fareler patojen içermeyen koşullarda muhafaza edildi ve tüm prosedürler Baylor College of Medicine'ın Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Fare hazırlığı
<ol><li>Cross Mx1-Cre17 ve Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 fare (Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı) αSMA-GFP fareleri ile (burada Drs tarafından sağlanmıştır). Ivo Kalajzic ve Henry Kronenberg) Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) muhabir fareleri üretmek için (Şekil 2A).</li>
	<li>Mx1-Cre indüksiyonu için, farelere 10 gün boyunca her gün 25 mg / kg pIpC enjekte edin.</li>
	<li>Vahşi tip C57BL/6 farelerden (WT-BMT)19'dan 1 x 106 bütün kemik iliği mononükleer hücrelerinin intravenöz naklinden 1 gün önce 9,5 Gy ile fareleri ışınlayın.</li>
	<li>6 ila 8 haftalık iyileşmeden sonra, fareleri aşağıda açıklanan periosteal hücre göç protokolünün in vivo görüntülemesine tabi edin. NOT: Mx1-Cre farelerinin ışınlanması ve WT-BMT, bir yaralanmaya yanıt verebilen endojen Mx1 etiketli hematopoetik hücreleri ortadan kaldırmak için gereklidir. Işınlama sonrası altı ila sekiz hafta, konağın hematopoetik hücre sayısı% <5'tedir ve böylece görüntülemeye hazırdır19.</li>
</ol>2. Fare tutma ve görüntüleme montajı
<ol><li>50 mL konik tüp ile bir fare kısıtlaması oluşturun (Şekil 1A).<ol>
<li>Sivri makas kullanarak konikin dibinden bir delik açın. Alt delikten konilerin üstüne kesin (kesilen taraf kısıtlamanın üst kısmı olacaktır).</li>
		<li>Önceki kesime paralel olarak yaklaşık 4-5 cm uzunluğunda ve kısıtlamanın üstünden yarıya kadar (~2 cm) bir kesim yapın. Konik bu bölümü çıkarın ve kenarları pürüzsüzleştirin gerekliydi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ayarlanabilir bir açı plakası, 0,5" optik direk ve 0,5" post, 0,1875" Hex (Şekil 1B ve Malzeme Masası) için dik açılı bir kelepçe kullanarak konik bir tüp görüntüleme montajı oluşturun.<ol>
<li>Açı plakasını 35° açıya ayarlayın. Açı plakasının sol tarafında, optik direği plakanın arkasından ikinci deliğe vidalayın.</li>
		<li>Ayarlanabilir plakanın sağ tarafına, yaylı 0,1875" Hex kilitlemeli 0,25" başparmak vidasını önden ikinci deliğe ve plakadaki son deliklere yerleştirin. Dik açılı kelepçe, konik fare kısıtlamasını yerinde sabitlemek için optik direkle birlikte kullanılacaktır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ameliyat öncesi cerrahi prosedür
<ol><li>Fare anestezisi<ol>
<li>Ağrı yönetimi için, deri altından fareye ameliyattan 30-60 dakika önce sürekli salınımlı buprenorfin (1 mg / kg BW) enjekte edin.</li>
		<li>37.5 mg/mL ketamin, 1.9 mg/mL ksil ile 0.37 mg/mL asepromazin içeren kemirgen III CCM kombinasyonu (combo III) anestezi kullanarak fareleri uyuşturmak. Fareler için uygun dozaj, 1 kg vücut ağırlığı başına 0,75-1,50 mL'dir. Doz 30-45 dakika sürecektir.</li>
		<li>Fare uyuşturuldıktan sonra, göz dehidrasyonunu önlemek için steril bir pamuklu çubukla gözlere oftalmik merhem uygulayın.</li>
		<li>Uzun süreli görüntüleme için (>45 dk), uygun anestezi derinliğini korumak için anesteziyi tekrar uygulayarak aşağıdaki gibi uygulayabilirsiniz.<ol>
<li>Planlanan görüntüleme süresi boyunca anesteziyi korumak için yeterli miktarda kombo III ile 1 mL şırıngın hazırlayın (30 dakikalık ek sedasyon başına 0,75 mL/kg BW). Şırıngaya 12" tüplü 25 G kelebek iğne infüzyon seti takın ve anesteziyi boru ve iğneden geçirin.</li>
			<li>Kelebek iğnesini intraperitoneally yerleştirin, sonra iğneyi yerine bantleyin. NOT: Ek kombo III görüntüleme sırasında bu şekilde uygulanacaktır, böylece hayvanı hareket ettirmeye veya görüş düzlemini bozmaya gerek yoktur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İşlem boyunca 37°C'de tutulan bir ısıtma yastığı ile termal destek sağlayın. Uzun süreli görüntüleme için (>1 saat) ek sıvı desteği gerekecektir.  Ek sıvılar I.P.'ye görüntüleme sırasında ek Combo III veya deri altından 33 mL/kg salin (0.9 NaCl) sağlanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare kısıtlaması ve cerrahi bölgenin hazırlanması<ol>
<li>Başın üstünden mümkün olduğunca fazla saç çıkarmak için makas kullanın. Ameliyat bölgesinde kalan saçları çıkarmak için tıraş edilen bölgeye epilatör krem uygulayın.</li>
		<li>Farenin parmak sıkışmalarına yanıt vermeyerek tamamen uyuşturulmasını sağlayın. 15 dakika sonra, fare tam olarak uyuşturulmazsa, ikinci bir daha küçük kombo III dozu (<0.75 mL / kg BW) kullanın.</li>
		<li>Fareyi önce kısıtlama kuyruğuna yerleştirin, burnun konik kenarına hafifçe sarkacak şekilde yeterince geriye doğru kaydırarak yerleştirin.</li>
		<li>Tıbbi bant kullanarak ön pençeleri konik tüpün altına bantleyin.</li>
		<li>Konik tüpü fare ile 35° açıyla ayarlanmış ve dik açılı kelepçe kullanılarak sabit bir görüntüleme yuvasına yerleştirin (Şekil 1C).</li>
		<li>Fare görüntüleme yuvasında güvenli hale geldikten sonra, cerrahi bölgeyi betadin ovma ve% 70 izopropil alkolün alternatif önlükleriyle 3x temizleyin. Yine, hayvanın tamamen sakinleştirilerek uyuşturuldığını kontrol edin.</li>
		<li>Fareyi temiz bir emici ped için hareket ettirin ve büyük bir steril alan oluşturmak için farenin üzerine bir örtü yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cerrahi prosedür
<ol><li>Açma kesiği<ol>
<li>İnce uçlu tokmaklar kullanarak, cildi hemen sağ kulağa medial alın. Mikrodiseksiyon makası ile, kümesler tarafından tutulan cildi kesin. NOT: Yukarıda açıklanan yöntem kullanılarak kesiğin başlatılması, işlemden sonra dikiş için daha uygun yuvarlak bir kesi oluşturur.</li>
		<li>sol kulağa doğru ilk kesiden başlayarak enine bir kesi yapın (<1 cm).  İlk kesiden başlayarak hayvanın burnuna doğru başka bir kesi yapın (sağ gözün yanından ~ 2-3 mm).</li>
		<li>Cildi periosteumdan ayıran bağ dokusunu nazikçe kesmek için önseçimleri ve makası kullanarak cildi periosteumdan ayırın.</li>
		<li>Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, cilt kapağının üstüne biraz oftalmik merhem uygulayın.  Deri kapağını yavaşça alın ve sol gözün üzerine katlayın. Sagittal ve koronal dikişlerin kesişimi açıkça ortaya açılmalıdır (Şekil 1E). NOT: Oftalmik merhem cilt kapağını yerinde tutmak için kullanılır.</li>
		<li>Herhangi bir kan ve artık saç alanını temizlemek için açık yüzeyi steril PBS ile yıkayın. NOT: Gerekirse, kızardıktan sonra kalan tüyleri çıkarmak için ince uçlu tokalar kullanın, ancak periosteuma zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikro çatlak<ol>
<li>Calvaria üzerinde mikro çatlaklar oluşturmak için, 29 G insülin şırıngasının pistonunun pistonunun çıkarılmasının ve şırınganın arka ucunun 300-400 uL işareti civarında kesilmesi. NOT: Bu adım, yaralanmayı üretirken diseksiyon kapsamı altında manevra yapmayı kolaylaştırır.</li>
		<li>Bir eğimin ucunu (bir ila iki iğne genişliği) koronal dikişten buruna doğru ve sagittal sütür sağ kısmına bir ila iki iğne genişliği yerleştirin (Şekil 1E).</li>
		<li>Şırıngarı saat yönünde hafifçe döndürün, sonra saat yönünün tersine birkaç kez döndürün. NOT: Genç farelerde, dairesel bir mikro çatlak oluşturmak için çok az miktarda aşağı doğru basınca ihtiyaç vardır. Kanamaya neden olacağı ve görüntülemeye müdahale edeceği için iğnenin beyne nüfuz etmesine izin vermemeye dikkat edin.</li>
		<li>Mikro çatlak ~0,4 mm'ye genişletmek için 27 G'lık bir iğne kullanın. Kemik parçaları mikro çatlakta kalırsa, bölgeyi PBS ile yıkayın. Kemik parçaları hala mikro çatlakta kalırsa, 29 G iğnesini kullanarak hafifçe dışarı çıkarabilirsiniz.</li>
		<li>Sagittal dikişin sol tarafında bir yaralanma oluşturmak için 4.2.1–4.2.4 adımlarını tekrarlayın. NOT: Bu noktada iki seçenek vardır: 1) derhal CCL5 tedavisine (bölüm 4.3) ve görüntülemeye (bölüm 5) geçin; veya 2) bölüm 6'daki ameliyat sonrası işlemleri takiben cerrahi bölgeyi kapatın. 24 saat sonra fareyi tekrar uyuşturun, cerrahi görüşü yeniden açın, yaralanmayı CCL5 (bölüm 4.3) ile tedavi edin ve intravital görüntüleme (bölüm 5) ve ameliyat sonrası bakım (bölüm 6) gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CCL5 tedavisi<ol>
<li>RANTES (100 ng/mL) stoğundan, bodrum membran matrisi (Malzeme Masası) kullanarak 10 ng/mL'lik bir çözüm yapın. Matrisi sıvı halde tutmak için bu çözeltiyi buzda tutun.</li>
		<li>Her yaralanmayı 2-20 μL pipet kullanarak 2 μL CCL5 (10 ng/μL) ile tedavi edin (bu pipet ucu viskoz bir sıvı kullanırken daha etkili olan daha büyük bir çapa sahiptir). Matrisin katılaşmasına izin verin.</li>
		<li>Matris katılaştıktan sonra, dokunun susuz kalmamasını sağlamak için calvaria'yı deri kapağı ile hafifçe örtün. Görüntülemeden önce 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. İntravital görüntüleme
<ol><li>Mikroskop ayarları<ol>
<li>Çoktoğraf lazeri açın (femtosaniye titanyum-safir lazer). Dalga boyunun 880 nm olarak ayarlanması ve kemiğin ikinci harmonik nesil (SHG) görüntüleme (440 nm) için gücü ayarlayın.</li>
		<li>GFP ve tdTomato ifade hücrelerinin çıkarılması için sırasıyla 488 nm ve 561 nm katı hal lazerlerini açın.</li>
		<li>İkinci harmonik üretim (405–455 nm algılama) ve GFP (505–550 nm algılama) sinyalleri için PMT (fotomultiplier tüp) dedektörlerini açın. Domates (590–620 nm algılama) sinyali için HyD 3 dedektörünü açın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montaj<ol>
<li>Fareyi dürbüne taşımadan önce, farenin başının arkasına hafifçe basarak calvaria'nın görsel düzlemini kontrol edin. Düzlem düzlem değilse, fare kısıtlamasını yavaşça sola veya sağa döndürerek konumu ayarlayın. NOT: Bu, yeterli görüntü kalitesini sağlamak için kritik bir adımdır.</li>
		<li>Tüm kalvaria ve cilt kapağını örtmek ve dokunun kurumasını önlemek için suya (w/v) steril% 2 metilselüloz uygulayın.</li>
		<li>Fareyi XYZ eksenli motorlu mikroskop aşamasına yerleştirin (Şekil 1G). Epifluoresan ışığı kullanarak, fareyi 1) mikroskop ve 2) koronal ve sagittal dikişlerin kesişimi sahnenin ortalanmış referans noktası olacak şekilde hizalayın.</li>
		<li>Cam kapağı görüntüleme alanına yerleştirin ve hizalamayı iki kez kontrol edin (Şekil 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hızlandırılmış görüntüleme<ol>
<li>Calvaria'yı taramak için düşük büyütme lensi (NA = 0,95 ile 25x su daldırma hedefi) kullanın. Sagittal ve koronal dikiş kesişiminin referans görüntüsünü alın.</li>
		<li>Hücrelerden gelen SHG ve floresan sinyallerini kullanarak, her yaralanma görüşünü bulun ve XYZ koordinatlarının yanı sıra sagittal ve koronal dikişlerden uzaklıkları kaydedin (Şekil 2B).</li>
		<li>Uzun süreli görüntüleme için koronal veya sagittal dikişlerde bir konum seçin. Görüntüleme sırasında referanstan bu alanın ayrıntılı bir Z yığını görüntüsünü alın. NOT: Dikişler bilinen bir P-SSC nişini temsil ettiği için, hücrelerin calvaria yaralanmasına yanıt olarak göç edeceği yer burasıdır.</li>
		<li>En az 1 saat boyunca her 1 dakikada bir görüntü kaydetmek için zaman atlamalı yazılım ayarlarını kullanın. Anlık görüntüler arasındaki süre içinde, geçerli görünüm alanını ilk görüş alanıyla karşılaştırın. Farklılarsa, görüş alanının hangi yönde ayarlanması gerektiğini belirlemek için Z yığını görüntüsünü kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Ameliyat sonrası hayvan bakımı
<ol><li>Görüntülemeden sonra, metilselülozu çıkarmak için maruz kalan calvaria'yı steril PBS ile durulayın.</li>
	<li>Kesiği kapatmak için, cilt kapağını calvaria üzerine hafifçe yerleştirin. Artık oftalmik merhemleri çıkarmak ve kesi bölgesini kurutmak için steril pamuklu çubuklar kullanın.</li>
	<li>Bağlı bir C-1 ters kesme iğnesi ile monofilament naylon 5-0 boyutlu nonabsorbable dikişler kullanarak cerrahi bölgeyi kapatın. Kapalı kesiye üçlü antibiyotik merhem uygulamak için steril bir pamuklu çubuk kullanın. NOT: Yüksek kaliteli dikiş teknikleri ve minimum kanama ile yara izi azalır.</li>
	<li>Fareyi sıcak bir yüzeyde temiz bir kafese yerleştirin ve sternal reumbency elde edilene kadar her 15 dakikada bir kontrol edin.</li>
	<li>Ameliyat sonrası 72 saat sürekli salınımlı buprenorfin ikinci bir doz uygulamak.</li>
	<li>Dikişler çıkarılana kadar (~1 hafta) huddling davranışı, fırfırlı kürk ve/veya ambülasyon eksikliği için günlük olarak izleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+mechanisms+and+interventions.">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li><li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture.">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li><li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration.">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li><li>Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+periosteum+for+skeletal+regeneration:+the+stem+cell+that+lies+beneath.">Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath.</a> Bone. 70, 10-18 (2015).</li><li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin.">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).</li><li>Olivos-Meza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+of+periosteum+with+TGF-beta1+in+situ+enhances+the+quality+of+osteochondral+tissue+regenerated+from+transplanted+periosteal+grafts+in+adult+rabbits.">Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).</li><li>Debnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+periosteal+stem+cell+mediating+intramembranous+bone+formation.">Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation.</a> Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).</li><li>Ransom, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axin2-expressing+cells+execute+regeneration+after+skeletal+injury.">Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury.</a> Scientific Reports. 6, 36524 (2016).</li><li>Ouyang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prx1+and+3.2kb+Col1a1+promoters+target+distinct+bone+cell+populations+in+transgenic+mice.">Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice.</a> Bone. 58, 136-145 (2013).</li><li>Wilk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Calvarial+Skeletal+Stem+Cells+Expressing+PRX1+Reside+Exclusively+in+the+Calvarial+Sutures+and+Are+Required+for+Bone+Regeneration.">Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).</li><li>Ortinau, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Functionally+Distinct+Mx1+alphaSMA++Periosteal+Skeletal+Stem+Cells.">Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).</li><li>Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+gene+expression+identifies+distinct+molecular+signatures+of+bone+marrow-+and+periosteal-skeletal+stem/progenitor+cells.">Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).</li><li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+during+fracture+repair:+The+cellular+picture.">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+identifies+osteogenic+progenitors+for+bone+formation+and+fracture+repair.">Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).</li><li>Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin-receptor-expressing+mesenchymal+stromal+cells+represent+the+main+source+of+bone+formed+by+adult+bone+marrow.">Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).</li><li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells.">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+marrow+MSCs+are+dynamic,+fate-restricted+participants+in+bone+maintenance+and+regeneration.">Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).</li><li>Nitzsche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+MSC+Adhesion+Cascade-Insights+into+Homing+and+Transendothelial+Migration.">Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration.</a> Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).</li><li>Adler, J., Pagakis, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+image+distortions+due+to+temperature-related+microscope+stage+drift.">Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift.</a> Journal of Microscopy. 210, 131-137 (2003).</li><li>Roberts, S. J., Ke, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anabolic+Strategies+to+Augment+Bone+Fracture+Healing.">Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing.</a> Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).</li></ol>

L.C.O. ve D.P., "Kemik Onarımında Periosteal İskelet Kök Hücreleri" (BAYM) başlıklı bekleyen bir patenti açıkladılar. P0264US. P1). Geri kalan yazarlar rakip çıkar beyan etmemektedir.

Kemik iyileşmesi sırasında periosteal hücreler, bir yaralanma callusu içinde yeni farklılaşmış kondrositlerin ve osteoblastların ana kaynağıdır3. Kemik iliğine benzer şekilde periosteum4,5,6'da osteojenik/kondrojenik SSC'ler de tanımlanmıştır. Endojen P-SSC fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek teknik olarak zordur. Genellikle, SSC'lerin göçmen dinamikleri in vitro olarak değerl...

Kırık onarımı embriyonik iskelet gelişimi ve tadilattan farklı dinamik, çok hücreli bir süreçtir. Bu süreçte, hasarlı dokudan gelen yaralanma sinyallerinin indüksiyonunu, kırıkların genel stabilitesi ve sabitlenmesi için kritik öneme sahip olan iskelet sapı/progenitör hücrelerinin hızlı bir şekilde işe alınması, çoğalması ve daha sonra farklılaşması takip eder1. Özellikle, kırık iyileşmesinin erken aşamaları, esas olarak periosteal yerleşik hücrelere atfedilen yumuşak nasır oluşumunu gerektirir2. Kemikler yaralandığında, periosteal hücrelerin bir alt kümesi hızla yanıt verir ve callus3 içindeki yeni farklılaşan kıkırdak aralarına ve osteoblastlara katkıda bulunur ve periosteum içinde belirgin bir iskelet sapı / progenitör hücre popülasyonunun varlığını bu işe bular. Bu nedenle periosteumda yerleşik iskelet kök hücrelerinin (SSC) tanımlanması ve fonksiyonel karakterizasyonu dejeneratif kemik hastalıkları ve kemik defektleri için umut verici bir terapötik yaklaşım oluşturmaktadır4.
SSC'lerin kemik iliği de dahil olmak üzere birden fazla doku bölgesinde bulunduğu düşünülmektedir. Kemik iliğine benzer şekilde periosteum4,5,6'da osteojenik/kondrojenik SSC'ler de tanımlanmıştır.  Bu periosteal SSC'ler (P-SSC'ler) fetal kemik gelişimi sırasında erken mezenkimal soy belirteçleri (örneğin Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 ve Axin2-CreER8) ile etiketlenebilir4,7,8,9,10. Bu tek genetik soy izleme modellerinin önemli bir sınırlaması, etiketli hücre popülasyonlarında önemli bir heterojenlik olmasıdır. Ayrıca, etiketli SSC'leri progeny in vivo'larından ayırt edemezler. Bu sınırlamayı gidermek için, yakın zamanda kemik iliği SSC'lerinden (BM-SSC'ler)11'den P-SSC'leri belirgin bir şekilde görselleştirmek için çift muhabir fare (Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) geliştirdik. Bu model ile P-SSC'lerin Mx1+αSMA+ çift etiketleme ile işaretlendiği, daha farklılaştırılmış Mx1+ hücrelerinin ise kemik iliği, endosteal ve periosteal yüzeyler ile kortikal ve trabeküler kemiklerde bulunduğu tespit edilmiştir11,12.
Çoklu sitokinler ve büyüme faktörlerinin kemik tadilatını ve onarımını düzenlediği bilinmektedir ve kritik segment kusurlarında iskelet onarımının arttırıcısı için test edilmiştir1,13. Bununla birlikte, kemik bölmesinin fiziksel bariyerinin bozulmasıyla ortaya çıkan yaralanma modellerinin hücresel karmaşıklığı nedeniyle, bu moleküllerin endojen P-SSC göçü ve iyileşme sırasında aktivasyon üzerindeki doğrudan etkileri belirsizdir. SSC'lerin fonksiyonel özellikleri ve göçmen dinamikleri genellikle diğer hücre popülasyonlarında göçü teşvik ettiği bilinen sitokinler veya büyüme faktörleri ile birlikte bir transwell veya scratch tahlil yapılarak in vitro olarak değerlendirilir. Bu nedenle, bu in vitro deneylerden elde edilen sonuçların ilgili in vivo sistemlerinde uygulanması için yorumlanması zordur. Şu anda, iskelet sapı / progenitör hücre göçünün in vivo değerlendirmesi tipik olarak gerçek zamanlı olarak gözlenmez; aksine, kırık sonrası sabit zaman noktalarında ölçülür5,7,14,15,16.
Bu yöntemin bir sınırlaması, geçişin tek hücre düzeyinde değerlendirilmemesidir; bunun yerine, hücre popülasyonlarındaki değişikliklerle ölçülür. Canlı hayvan intravital mikroskopislerindeki son gelişmeler ve ek muhabir farelerin üretimi nedeniyle, bireysel hücrelerin in vivo takibi artık mümkündür. Canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanarak, Mx1/Tomato/αSMA-GFP farelerinde 24-48 saat yaralanma sonrası kemik hasarında P-SSC'lerin kalvaria dikiş nişinden kemik yaralanmasına belirgin göçünü gözlemledik.
CCL5/CCR5 yakın zamanda erken yaralanma yanıtı sırasında işe alım ve aktivasyon P-SSC'lerini etkileyen düzenleyici bir mekanizma olarak tanımlandı. İlginçtir ki, gerçek zamanlı olarak bir yaralanmaya yanıt olarak önemli bir P-SSC göçü tespit edilmemiştir. Bununla birlikte, CCL5 ile bir yaralanmanın tedavisi, gerçek zamanlı olarak yakalanabilen sağlam, yönlü olarak farklı bir P-SSC göçü üretir. Bu nedenle, bu protokolün amacı, CCL5 ile tedaviden sonra P-SSC'lerin in vivo geçişini gerçek zamanlı olarak kaydetmek için ayrıntılı bir metodoloji sağlamaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="719">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">&#189;&#8221; optical post</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:135px;">TR2</td>
			<td style="width:247px;">For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">27G needle</td>
			<td style="width:175px;">BD PercisionGlide</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">29G insulin syringe</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>102-SN05C905P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">50 mL conicol tube</td>
			<td style="width:175px;">Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>For mouse restraint</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Adjustable angle plate</td>
			<td style="width:175px;">Renishaw</td>
			<td>R-PCA-5023-50-20</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:175px;">Coviden</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">betadine surgical scrub</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Buprenorphine SR-LAB</td>
			<td style="width:175px;">ZooPharm</td>
			<td></td>
			<td>1mg/mL Sustained Release</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Combo III</td>
			<td style="width:175px;">Obtained from staff veterinarian</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:247px;">37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Coverslip</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td>24 x 40 premium superslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Fine tip forcepts</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Ketamine</td>
			<td style="width:175px;">KetaVed</td>
			<td>50989-161-06</td>
			<td style="width:247px;">100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td>
			<td style="width:175px;">Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Matrigel</td>
			<td style="width:175px;">R &#38; D Systems</td>
			<td>344500101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:164px;">Medical tape</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>100199</td>
			<td>3&#34; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Methocellulose</td>
			<td style="width:175px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Microdissection scissors</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>1456-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:175px;">Anaheim automation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Needle holder</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Nonabsorbable sutures</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>S913BX</td>
			<td style="width:247px;">monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Rugby</td>
			<td>0536-1086-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">RANTES</td>
			<td style="width:175px;">Biolegend</td>
			<td>594202</td>
			<td>10 &#181;g/50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Right-angle clamp for &#189;&#8221; post, 3/16&#8221; Hex</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Spring-loaded 3/16&#8221; Hex-locking &#188;&#8221; thumbscrew</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>TS25H</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile cotton swabs</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>100-9249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile DPBS (1x)</td>
			<td style="width:175px;">Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:164px;">Sterile drapes</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>25-517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Surgical gloves</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>3158VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Triple antibiotic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td>
			<td>51672-2120-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">REF 367298</td>
			<td style="width:247px;">25G butterfly needle infusion set with 12&#34; tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

Periosteal iskelet kök hücreleri (P-SSC' ler) ömür boyu kemik bakımı ve onarımı için gereklidir, bu da onları kırık iyileşmesini artırmak için tedavilerin geliştirilmesi için ideal bir odak noktası haline getirir.  Periosteal hücreler, kırık iyileşmesi için yeni kondrositler ve osteoblastlar sağlamak için hızla bir yaralanmaya göç eder. Geleneksel olarak, bir sitokinin hücre göçünü teşvik etme etkinliği sadece transwell veya scratch tahlil yapılarak in vitro olarak gerçeklenmiştir. Multifotoni ekscitasyonu kullanılarak intravital mikroskopideki gelişmelerle, yakın zamanda 1) P-SSC'lerin göçmen geni CCR5 ve 2) CCL5 olarak bilinen CCR5 ligand ile tedavinin kırık iyileşmesini ve CCL5'e yanıt olarak P-SSC'lerin göçini iyileştirdiği keşfedilmiştir. Bu sonuçlar gerçek zamanlı olarak yakalandı. Burada açıklanan, CCL5 ile tedavi edildikten sonra kalvarial dikiş iskelet kök hücresi (SSC) nişinden yaralanmaya doğru P-SSC geçişini görselleştirmek için bir protokoldür. Protokol, bir fare kısıtlaması ve görüntüleme montajının yapımını, fare kalvarisinin cerrahi olarak hazırlanmasını, bir calvaria kusurunun indüksiyonunu ve zaman atlamalı görüntülemenin kazanılmasını detaylandırıyor.

İskelet atalarının göçmen veya dolaşım potansiyeline sahip olduğu önerilmiştir20. Son zamanlarda, Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) muhabir fareleri üretildi ve P-SSC'ler Mx1+α SMA+ çift etiketleme ile işaretlendi (Şekil 2A,B). Mx1+α SMA+ P-SSC'lerin öneml...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice at JoVE.com

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Bu protokol, canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanılarak CCL5 aracılı periosteal iskelet kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak saptanmasıdır.

Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Bu protokol, canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanılarak CCL5 aracılı periosteal iskelet kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak saptanmasıdır.

Video: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

İmmün eksik farelerde İnsan İskelet Kası Ksenogreftlerinin

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...