Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Doenças Ósseas do Texas Award, o Caroline Wiess Law Fund Award, e o NIAMS dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de premiação R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 para D.P.  Agradecemos a M.E. Dickinson e T.J. Vadakkan no BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core e nos BCM Advanced Technology Cores com financiamento do NIH (AI036211, CA125123 e DK056338).
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Todos os camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Baylor College of Medicine.
1. Preparação do rato
<ol><li>Cross Mx1-Cre17 e Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 ratos (comprados do Laboratório Jackson) com camundongos αSMA-GFP (fornecidos aqui pelos Drs. Ivo Kalajzic e Henry Kronenberg) para gerar ratos repórteres Mx1-Cre+Rosa26-Tomate+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomate/αSMA-GFP) (Figura 2A).</li>
	<li>Para indução Mx1-Cre, injete camundongos com 25 mg/kg pIpC a cada dois dias durante 10 dias.</li>
	<li>Camundongos irradiados com 9,5 Gy 1 dia antes do transplante intravenoso de 1 x 106 células mononucleares de medula óssea inteiras de camundongos tipo selvagem C57BL/6 (WT-BMT)19.</li>
	<li>Após 6 a 8 semanas de recuperação, sujeitos a camundongos a imagem in vivo do protocolo de migração celular periosteal descrito abaixo. NOTA: Irradiação e WT-BMT de camundongos Mx1-Cre são necessários para eliminar células hematopoiéticas endógenas rotuladas por Mx1 que podem responder a uma lesão. De seis a oito semanas após a irradiação, a contagem de células hematopoiéticas do hospedeiro está em <5% e, portanto, pronta para imagens19.</li>
</ol>2. Contenção do rato e montagem de imagem
<ol><li>Crie uma contenção do mouse com um tubo cônico de 50 mL (Figura 1A).<ol>
<li>Usando uma tesoura pontiaguda, faça um buraco na parte inferior do cônico. Corte do orifício inferior até o topo do cônico (o lado cortado será o topo da contenção).</li>
		<li>Faça um corte de aproximadamente 4-5 cm de comprimento paralelo ao corte anterior e metade abaixo (~2 cm) do topo da contenção. Remova esta seção do cônico e liso as bordas foram necessárias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construa um suporte de imagem de tubo cônico usando uma placa angular ajustável, um poste óptico de 0,5" e um grampo de ângulo reto para o poste de 0,5", Hex de 0,1875" (Figura 1B e Tabela de Materiais).<ol>
<li>Ajuste a placa angular para um ângulo de 35°. No lado esquerdo da placa angular, enrosque o poste óptico no segundo orifício da parte de trás da placa.</li>
		<li>No lado direito da placa ajustável, insira um parafuso de 0,1875" hexarifado de 0,25" na segunda furo da frente e último furo na placa. O grampo de ângulo reto será usado com o poste óptico para fixar a contenção cônica do mouse no lugar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procedimento cirúrgico pré-operatório
<ol><li>Anestesia do rato<ol>
<li>Para o tratamento da dor, injete subcutâneamente o camundongo com buprenorfina de liberação sustentada (1 mg/kg BW) 30-60 min antes da cirurgia.</li>
		<li>Camundongos anestesiadores usando a combinação de roedor III CCM (combo III) anestésia contendo 37,5 mg/mL de cetamina, 1,9 mg/mL de xilazina e acepromazina de 0,37 mg/mL. A dosagem apropriada para camundongos é de 0,75-1,50 mL por 1 kg de peso corporal. A dose durará de 30 a 45 min.</li>
		<li>Uma vez que o rato seja anestesiado, aplique pomada oftálmica nos olhos com um cotonete estéril para evitar a desidratação dos olhos.</li>
		<li>Para imagens de longo prazo (>45 min), administre novamente a anestesia para manter a profundidade anestésica adequada da seguinte forma.<ol>
<li>Prepare uma seringa de 1 mL com uma quantidade suficiente de combo III para manter a anestesia para a duração da imagem planejada (0,75 mL/kg BW por 30 min de sedação adicional). Conecte um conjunto de infusão de agulha de borboleta de 25 G com tubos de 12" à seringa e empurre o anestésico através da tubulação e agulha.</li>
			<li>Insira a agulha borboleta intraperitoneally e, em seguida, grave a agulha no lugar. NOTA: É assim que o combo III adicional será administrado durante a imagem de tal forma que não há necessidade de mover o animal ou interromper o plano de visão.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forneça suporte térmico com uma almofada de aquecimento mantida a 37°C durante todo o procedimento. Para uma imagem prolongada (>1hr) será necessário suporte adicional de fluido.  Os fluidos suplementares podem ser fornecidos I.P. com combo III adicional durante a imagem ou 33 mL/kg salino (0,9 NaCl) subcutânea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contenção do rato e preparação do local cirúrgico<ol>
<li>Use cortadores para remover o máximo de cabelo possível da parte superior da cabeça. Aplique creme depilatório na área raspada para remover qualquer cabelo restante no local cirúrgico.</li>
		<li>Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado pela falta de resposta às pitadas dos dedos dos dedos. Após 15 min, se o mouse não estiver totalmente anestesiado, administre uma segunda dose menor de combo III (<0,75 mL/kg BW).</li>
		<li>Coloque o mouse na tampa da cauda primeiro, deslizando-o para trás o suficiente para trás, de tal forma que o nariz paira ligeiramente sobre a borda do cônico.</li>
		<li>Grave as patas dianteiras na parte inferior do tubo cônico usando fita médica.</li>
		<li>Coloque o tubo cônico com o mouse em uma montagem de imagem que é definida em um ângulo de 35° e fixe usando o grampo de ângulo reto (Figura 1C).</li>
		<li>Uma vez que o rato esteja seguro no suporte de imagem, limpe o local cirúrgico 3x com esfoliantes alternados de esfoliação betadina e 70% de álcool isopropílico. Novamente, verifique se o animal está totalmente sedado.</li>
		<li>Mova o mouse para uma almofada absorvente limpa e coloque uma cortina sobre o mouse para criar um grande campo estéril.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Procedimento cirúrgico
<ol><li>Abertura incisão<ol>
<li>Usando fórceps finos, pegue a pele imediatamente medial para a orelha direita. Com uma tesoura de microdisseção, corte a pele que está sendo mantida pelos fórceps. NOTA: Iniciar a incisão utilizando o método descrito acima cria uma incisão arredondada mais adequada para sutura após o procedimento.</li>
		<li>Faça uma incisão transversal a partir da incisão inicial em direção à orelha esquerda (<1 cm).  Faça outra incisão, a partir da incisão inicial, em direção ao nariz do animal (~2-3 mm além do olho direito).</li>
		<li>Separe a pele do periósteo usando as fórceps e a tesoura para cortar suavemente o tecido conjuntivo que separa a pele do periosteum calvaria.</li>
		<li>Usando um cotonete estéril, aplique alguma pomada oftálmica no topo da aba da pele.  Pegue suavemente a aba da pele e dobre-a sobre o olho esquerdo. A intersecção das suturas sagiais e coronais deve ser claramente exposta (Figura 1E). NOTA: A pomada oftalmômica é usada para manter a aba da pele no lugar.</li>
		<li>Lave a superfície aberta com PBS estéril para limpar a área de qualquer sangue e cabelo residual. NOTA: Se necessário, use fórceps finos para remover os cabelos que permanecem após a descarga, mas tenha cuidado para não danificar o periósteo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microfratura<ol>
<li>Para gerar microfraturas na calvária, remova o êmbolo de uma seringa de insulina de 29 G e corte a parte de trás da seringa, em torno das marcas de 300-400 uL. NOTA: Esta etapa facilita a manobra sob um escopo de dissecção ao produzir a lesão.</li>
		<li>Coloque a ponta de um bisel (uma a duas larguras de agulha) em direção ao nariz a partir da sutura coronal e de uma a duas larguras de agulha à direita da sutura sagital (Figura 1E).</li>
		<li>Gire suavemente a seringa no sentido horário, depois no sentido anti-horário várias vezes. NOTA: Em camundongos jovens, uma quantidade muito pequena de pressão descendente é necessária para criar uma microfratura circular. Tenha cuidado para não deixar a agulha penetrar no cérebro, pois isso causará sangramento e interferirá com a imagem.</li>
		<li>Use uma agulha de 27 G para ampliar a microfratura para ~0,4 mm. Se os fragmentos ósseos permanecerem na microfratura, lave a área com PBS. Se os fragmentos ósseos ainda permanecerem na microfratura, use a agulha de 29 G para retirá-los suavemente.</li>
		<li>Repita os passos 4.2.1-4.2.4 para criar uma lesão no lado esquerdo da sutura sagital. NOTA: Neste ponto, há duas opções: 1) seguir imediatamente para o tratamento CCL5 (seção 4.3) e imagem (seção 5); ou 2) fechar o local cirúrgico seguindo os procedimentos pós-operatórios na seção 6. Às 24 horas depois, anestesiar novamente o camundongo, reabrir a visão cirúrgica, tratar a lesão com CCL5 (seção 4.3) e realizar imagens intravitais (seção 5) e cuidados pós-operatórios (seção 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tratamento CCL5<ol>
<li>A partir de um estoque de RANTES (100 ng/mL), faça uma solução de 10 ng/mL usando matriz de membrana de porão (Tabela de Materiais). Mantenha esta solução no gelo para manter a matriz em forma líquida.</li>
		<li>Trate cada lesão com 2 μL de CCL5 (10 ng/μL) usando uma pipeta de 2-20 μL (esta ponta de pipeta tem um diâmetro maior, que é mais eficaz ao usar um líquido viscoso). Permita que a matriz se solidifique.</li>
		<li>Uma vez que a matriz se solidificou, cubra suavemente a calvaria com a aba da pele para garantir que o tecido não fique desidratado. Incubar por 1h antes da imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Imagem intravital
<ol><li>Configurações de microscópio<ol>
<li>Ligue o laser multifotônio (laser de femtosegundo de titânio-safira). Ajuste o comprimento de onda para 880 nm e ajuste a potência para a segunda imagem de geração harmônica (SHG) (440 nm) do osso.</li>
		<li>Ligue os lasers de estado sólido de 488 nm e 561 nm para excitação de células de voz de GFP e tdTomato, respectivamente.</li>
		<li>Ligue os detectores PMT (tubo fotomultiplier) para sinais de segunda geração harmônica (detecção de 405 a 455 nm) e GFP (detecção de 505-550 nm). Ligue o detector HyD 3 para o sinal de tomate (detecção de 590-620 nm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montagem<ol>
<li>Antes de mover o mouse para o escopo, verifique o plano visual da calvaria pressionando suavemente a parte de trás da cabeça do mouse. Se o plano não estiver nivelado, ajuste a posição girando suavemente a contenção do mouse para a esquerda ou para a direita. NOTA: Esta é uma etapa crítica para garantir qualidade de imagem suficiente.</li>
		<li>Aplique 2% de metilcelulose estéril na água (c/v) para cobrir toda a panturrilha e retalho da pele e evitar a secagem do tecido.</li>
		<li>Coloque o mouse no estágio do microscópio motorizado do eixo XYZ (Figura 1G). Utilizando a luz epifluorescente, alinhe o mouse de modo que 1) ele está voltado para o microscópio e 2) a intersecção das suturas coronais e sagita é o ponto de referência central do palco.</li>
		<li>Coloque a tampa de vidro na área de imagem e verifique novamente o alinhamento (Figura 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagem de lapso de tempo<ol>
<li>Use uma lente de baixa ampliação (objetivo de imersão em água de 25x com NA = 0,95) para escanear a calvaria. Adquirir uma imagem de referência da intersecção sagital e coronal de sutura.</li>
		<li>Usando os sinais SHG e fluorescentes das células, localize cada visão de lesão e registre as coordenadas XYZ, bem como as distâncias das suturas sagita e coronal (Figura 2B).</li>
		<li>Escolha um local nas suturas coronais ou sagitas para imagens de longo prazo. Tire uma imagem detalhada da pilha Z desta área a partir da referência durante a imagem. NOTA: Como as suturas representam um nicho P-SSC conhecido, é de onde as células migrarão em resposta à lesão da calvária.</li>
		<li>Use as configurações do software time-lapse para gravar uma imagem a cada 1 minuto por pelo menos 1 h. No tempo entre instantâneos, compare o campo de visão atual com o campo de visão inicial. Se forem diferentes, use a imagem da pilha Z para determinar em que direção o campo de visão precisa ser ajustado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Cuidados com animais pós-operatórios
<ol><li>Após a imagem, enxágue a calvária exposta com PBS estéril para remover o metilcelulose.</li>
	<li>Para fechar a incisão, coloque suavemente a aba da pele sobre a calvaria. Use cotonetes estéreis para remover a pomada oftalmómica residual e secar o local da incisão.</li>
	<li>Utilizando suturas nãoabsorbáveis de nylon de monofilamento 5-0 com uma agulha de corte reversa C-1 anexada, feche o local cirúrgico. Use um cotonete estéril para aplicar pomada antibiótico tripla à incisão fechada. NOTA: As cicatrizes são reduzidas com técnicas de sutura de alta qualidade e sangramento mínimo.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma superfície quente e verifique a cada 15 minutos até que a recumedência severa seja alcançada.</li>
	<li>Administre uma segunda dose de buprenorfina de liberação sustentada 72 h após a cirurgia.</li>
	<li>Monitore diariamente o comportamento amontoado, a pele de babados e/ou a falta de ambulação até que as suturas sejam removidas (~1 semana).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+mechanisms+and+interventions.">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li><li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture.">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li><li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration.">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li><li>Roberts, S. 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L.C.O. e D.P. divulgam uma patente pendente intitulada "Células-Tronco Esqueléticas Periosteais em Reparação Óssea" (BAYM. P0264Us. P1). Os demais autores não declaram interesses concorrentes.

Durante a cicatrização óssea, as células periosteais são a principal fonte de condrócitos e osteoblastos recém-diferenciados dentro de um calo de lesão3. Semelhante à medula óssea, os SSCs osteogênicos/condrogênicos também foram identificados no periosteum4,5,6. Avaliar características funcionais P-SSC endógenas é tecnicamente desafiador. Muitas vezes, a dinâmica migratória dos SSCs é a...

O reparo da fratura é um processo dinâmico e multicelular distinto do desenvolvimento e remodelação esquelético embrionário. Durante esse processo, a indução de sinais de lesão do tecido danificado é seguida pelo rápido recrutamento, proliferação e subsequente diferenciação das células esqueléticas de tronco/progenitor, que são todas fundamentais para a estabilidade geral e fixação de fraturas1. Em particular, os estágios iniciais da cicatrização da fratura requerem a formação de calo macio, que é atribuída principalmente às células residentes periosteis2. Quando os ossos são feridos, um subconjunto de células periosteais responde rapidamente e contribui para intermediários de cartilagem e osteoblastos recém-diferenciados dentro do calo3, implicando a presença de uma distinta população de células-tronco/progenitoras esqueléticas dentro do peristeum. Portanto, a identificação e caracterização funcional das células-tronco esqueléticas residentes no periosteum (SSCs) constituem uma abordagem terapêutica promissora para doenças ósseas degenerativas e defeitos ósseos4.
Acredita-se que os SSCs residam em vários locais de tecido, incluindo a medula óssea. Semelhante à medula óssea, os SSCs osteogênicos/condrogênicos também foram identificados no periosteum4,5,6.  Estes SSCs periosteais (P-SSCs) podem ser rotulados com marcadores de linhagem mesenquimal precoces (ou seja, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 e Axin2-CreER8) durante o desenvolvimento do osso fetal4,7,8,9,10. Uma limitação significativa desses modelos de rastreamento de linhagem genética única é que há heterogeneidade substancial dentro de populações celulares rotuladas. Além disso, eles não podem distinguir SSCs rotulados de seus descendentes in vivo. Para lidar com essa limitação, desenvolvemos recentemente um mouse repórter duplo (Mx1-Cre+Rosa26-Tomate+α SMA-GFP+) para visualizar distintamente P-SSCs de SSCs de medula óssea (BM-SSCs)11. Com este modelo, foi determinado que os P-SSCs são marcados pela rotulagem dupla Mx1+αSMA+, enquanto as células Mx1+ mais diferenciadas residem nas superfícies de medula óssea, endosteal e periosteal, e ossos cortical e trabecular11,12.
Várias citocinas e fatores de crescimento são conhecidos por regular a remodelação e reparação óssea e foram testados para o aprimoramento da reparação esquelética em defeitos críticos do segmento1,13. No entanto, devido à complexidade celular dos modelos de lesões gerados pela ruptura da barreira física do compartimento ósseo, os efeitos diretos dessas moléculas na migração e ativação endógena P-SSC durante a cicatrização não são claros. As características funcionais e a dinâmica migratória dos SSCs são frequentemente avaliadas in vitro pela realização de um ensaio transwell ou scratch, em combinação com citocinas ou fatores de crescimento conhecidos por induzir migração em outras populações celulares. Assim, a interpretação dos resultados desses experimentos in vitro para aplicação em seus sistemas in vivo correspondentes é desafiadora. Atualmente, a avaliação in vivo da migração de células-tronco/progenitor esqueléticos não é normalmente observada em tempo real; em vez disso, é medido em pontos de tempo fixos após a fratura5,7,14,15,16.
Uma limitação desse método é que a migração não é avaliada em um nível unicelular; em vez disso, é medido através de mudanças nas populações celulares. Devido aos recentes avanços na microscopia intravital animal vivo e à geração de ratos repórteres adicionais, o rastreamento in vivo de células individuais agora é possível. Utilizando microscopia intravital animal viva, observamos a migração distinta de P-SSCs do nicho de sutura da calvaria para uma lesão óssea dentro de 24-48 h pós-lesão em camundongos Mx1/Tomate/αSMA-GFP.
O CCL5/CCR5 foi recentemente identificado como um mecanismo regulatório que influenciou os P-SSCs de recrutamento e ativação durante a resposta precoce de lesões. Curiosamente, não houve detecção de migração P-SSC substancial em resposta a uma lesão em tempo real. No entanto, o tratamento de uma lesão com CCL5 produz uma migração robusta e direcionalmente distinta de P-SSCs, que pode ser capturada em tempo real. Portanto, o objetivo deste protocolo é fornecer uma metodologia detalhada para o registro da migração in vivo de P-SSCs em tempo real após o tratamento com CCL5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="719">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">&#189;&#8221; optical post</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:135px;">TR2</td>
			<td style="width:247px;">For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">27G needle</td>
			<td style="width:175px;">BD PercisionGlide</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">29G insulin syringe</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>102-SN05C905P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">50 mL conicol tube</td>
			<td style="width:175px;">Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>For mouse restraint</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Adjustable angle plate</td>
			<td style="width:175px;">Renishaw</td>
			<td>R-PCA-5023-50-20</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:175px;">Coviden</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">betadine surgical scrub</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Buprenorphine SR-LAB</td>
			<td style="width:175px;">ZooPharm</td>
			<td></td>
			<td>1mg/mL Sustained Release</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Combo III</td>
			<td style="width:175px;">Obtained from staff veterinarian</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:247px;">37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Coverslip</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td>24 x 40 premium superslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Fine tip forcepts</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Ketamine</td>
			<td style="width:175px;">KetaVed</td>
			<td>50989-161-06</td>
			<td style="width:247px;">100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td>
			<td style="width:175px;">Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Matrigel</td>
			<td style="width:175px;">R &#38; D Systems</td>
			<td>344500101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:164px;">Medical tape</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>100199</td>
			<td>3&#34; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Methocellulose</td>
			<td style="width:175px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Microdissection scissors</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>1456-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:175px;">Anaheim automation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Needle holder</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Nonabsorbable sutures</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>S913BX</td>
			<td style="width:247px;">monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Rugby</td>
			<td>0536-1086-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">RANTES</td>
			<td style="width:175px;">Biolegend</td>
			<td>594202</td>
			<td>10 &#181;g/50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Right-angle clamp for &#189;&#8221; post, 3/16&#8221; Hex</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Spring-loaded 3/16&#8221; Hex-locking &#188;&#8221; thumbscrew</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>TS25H</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile cotton swabs</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>100-9249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile DPBS (1x)</td>
			<td style="width:175px;">Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:164px;">Sterile drapes</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>25-517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Surgical gloves</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>3158VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Triple antibiotic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td>
			<td>51672-2120-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">REF 367298</td>
			<td style="width:247px;">25G butterfly needle infusion set with 12&#34; tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

As células-tronco esqueléticas periosteais (P-SSCs) são essenciais para a manutenção e reparação óssea ao longo da vida, tornando-as um foco ideal para o desenvolvimento de terapias para melhorar a cicatrização da fratura.  As células periosteais migram rapidamente para uma lesão para fornecer novos condrócitos e osteoblastos para cicatrização de fraturas. Tradicionalmente, a eficácia de uma citocina para induzir a migração celular só tem sido conduzida in vitro realizando um ensaio transwell ou scratch. Com os avanços na microscopia intravital utilizando excitação multifotífica, descobriu-se recentemente que 1) P-SSCs expressam o gene migratório CCR5 e 2) tratamento com o ligante CCR5 conhecido como CCL5 melhora a cicatrização da fratura e a migração de P-SSCs em resposta ao CCL5. Estes resultados foram capturados em tempo real. Descrito aqui é um protocolo para visualizar a migração P-SSC do nicho de células-tronco esqueléticas de sutura calvarial (SSC) para uma lesão após o tratamento com CCL5. O protocolo detalha a construção de um suporte de contenção e imagem do rato, preparação cirúrgica do rato calvaria, indução de um defeito de calvaria e aquisição de imagens de lapso de tempo.

Progenitores esqueléticos foram propostos para ter potencial migratório ou circulatório20. Recentemente, foram gerados ratos repórteres Mx1-Cre+Rosa26-Tomate+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomate/αSMA-GFP), nos quais os P-SSCs são marcados por rotulagem dupla Mx1+α SMA+ (Figura 2A,B). A migração substancial de Mx1+α <em...

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Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Este protocolo descreve a detecção da migração de células-tronco periósteis periósteis mediadas pelo CCL5 em tempo real usando microscopia intravital animal viva.

Imagem em tempo real da migração induzida por CCL5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K visualizações.  Baylor College of Medicine. Este protocolo descreve a detecção da migração de células-tronco periósteis periósteis mediadas pelo CCL5 em tempo real usando microscopia intravital animal viva.

Vídeo: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Biologia do Desenvolvimento

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Avaliação de danos oxidativos nas células de superfície ocular/células-tronco do rato primário em resposta ao dano ultravioleta-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Realizando xenoenxertos de músculo esquelético humano em camundongos imunodeficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...