עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מחלות העצמות של פרס טקסס, פרס קרן החוק קרוליין וויז, ואת NIAMS של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרס R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 ל- D.P.  אנו מודים ל- M.E. Dickinson ות.ג'יי וודאקאן בהדמיה אופטית BCM וליבת מיקרוסקופיה חיונית וליבות הטכנולוגיה המתקדמת BCM במימון NIH (AI036211, CA125123 ו- DK056338).
.

כל העכברים נשמרו בתנאים נטולי פתוגנים, וכל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכללת ביילור לרפואה (IACUC).
1. הכנת עכבר
<ol><li>קרוס Mx1-Cre17 ו-Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (טום)18 עכברים (שנרכשו ממעבדת ג'קסון) עם עכברי αSMA-GFP (מסופקים כאן על ידי ד"ר איבו קלג'זיץ' והנרי קרוננברג) כדי ליצור עכברי Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) עכברים (איור 2A).</li>
	<li>עבור אינדוקציה Mx1-Cre, להזריק עכברים עם 25 מ"ג/ק"ג pIpC כל יומיים במשך 10 ימים.</li>
	<li>עכברים הקרנה עם 9.5 Gy יום אחד לפני השתלה תוך ורידי של 1 x 106 תאים מונונוקלאריים של מח עצם שלם מעכברי C57BL/6 מסוג בר (WT-BMT)19.</li>
	<li>לאחר 6 עד 8 שבועות של התאוששות, עכברי נושא להדמיית in vivo של פרוטוקול העברת תאים periosteal המתואר להלן. הערה: הקרנה ו- WT-BMT של עכברי Mx1-Cre נחוצים כדי לחסל תאים hematopoietic בשם Mx1 אנדוגני שעלולים להגיב לפציעה. שישה עד שמונה שבועות לאחר ההקרנה, ספירת התאים ההמטו-מואטיאטיים של המארח עומדת על <5% ולכן מוכנה להדמיה19.</li>
</ol>2. ריסון עכבר והרכבה הדמיה
<ol><li>צור ריסון עכבר באמצעות צינור חרוט 50 מ"ל (איור 1A).<ol>
<li>באמצעות מספריים מחודדים, לתקוע חור דרך החלק התחתון של החרוט. חותכים מהחור התחתון לחלק העליון של החרוט (הצד החתוך יהיה החלק העליון של האיפוק).</li>
		<li>בצעו חתך באורך של כ-4-5 ס"מ במקביל לחתך הקודם ובחצי הדרך למטה (כ-2 ס"מ) מראש האיפוק. הסר קטע זה של החרוט וחלק את הקצוות היו נחוצים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בנה הרכב הדמיה של צינור חרוט באמצעות צלחת זווית מתכווננת, עמוד אופטי בגודל 0.5 אינץ' ומהדק בזווית ישרה עבור עמוד בגודל 0.5 אינץ', "0.1875 Hex (איור 1B וטבלת חומרים).<ol>
<li>התאם את לוח הזווית לזווית של 35°. בצד שמאל של צלחת הזווית, בורג את ההודעה האופטית לתוך החור השני מהחלק האחורי של הצלחת.</li>
		<li>בצד ימין של הלוח המתכוונן, הכנס חורים 0.1875 אינץ' משושלים 0.25 אינץ' לחור השני מהחזית וחורים אחרונים על הצלחת. המהדק בזווית ישרה ישמש עם העמוד האופטי כדי לאבטח את ריסון העכבר החרוט במקום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הליך כירורגי טרום ניתוחי
<ol><li>הרדמה של עכבר<ol>
<li>לטיפול בכאב, הזריקו לעכבר באופן תת עורי בופרנורפין שחרור מתמשך (1 מ"ג/ק"ג ב"ג) 30-60 דקות לפני הניתוח.</li>
		<li>עכברי מורדמים באמצעות שילוב CCM מכרסם III (משולב III) הרדמה המכילה 37.5 מ"ג / מ"ל קטמין, 1.9 מ"ג / מ"ל קסילאסין, ו 0.37 מ"ג / מ"ל acepromazine. המינון המתאים לעכברים הוא 0.75-1.50 מ"ל לכל 1 ק"ג של משקל גוף. המינון יימשך 30-45 דקות.</li>
		<li>לאחר העכבר הוא מרדים, להחיל משחה עיניים על העיניים עם צמר גפן סטרילי כדי למנוע התייבשות העין.</li>
		<li>להדמיה ארוכת טווח (>45 דקות), יש לבצע הרדמה שוב כדי לשמור על עומק הרדמה תקין כדלקמן.<ol>
<li>הכן מזרק 1 מ"ל עם כמות מספקת של משולב III כדי לשמור על הרדמה למשך ההדמיה המתוכננת (0.75 מ"ל / קילוגרם BW לכל 30 דקות של סם נוסף). חברו 25 גרם עירוי מחט פרפר עם צינורות בגודל 12 אינץ' למזרק ודחוף חומר הרדמה דרך הצינורות והמחט.</li>
			<li>הכנס את מחט הפרפר תוך-איטרא-איטרהוני, ואז תדביק את המחט במקומה. הערה: כך ינוהל המשולבת הנוספת III במהלך ההדמיה כך שאין צורך להזיז את החיה או לשבש את מישור הראייה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ספק תמיכה תרמית עם כרית חימום שנשמרה ב 37°C לאורך כל ההליך. להדמיה ממושכת (>1 שעות) יהיה צורך בתמיכה נוספת בנוזלים.  נוזלים משלימים ניתן לספק I.P. עם Combo III נוסף במהלך הדמיה או 33 מ"ל / קילוגרם מלוחים (0.9 NaCl) תת עורית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ריסון העכבר והכנת האתר הכירורגי<ol>
<li>השתמש קוצץ כדי להסיר שיער רב ככל האפשר מהחלק העליון של הראש. יש למרוח קרם דפילטורי על האזור המגולח כדי להסיר את כל השיער שנותר באתר הניתוח.</li>
		<li>ודא שהעכבר הוא מרדים לחלוטין על ידי חוסר תגובה צביטות בוהן. לאחר 15 דקות, אם העכבר אינו מרדים לחלוטין, לנהל מנה קטנה שנייה של משולב III (<0.75 מ"ל / קילוגרם BW).</li>
		<li>מניחים את העכבר בזנב האיפוק תחילה, מחליקים אותו מספיק אחורה כך שהאף תלוי מעט על קצה החרוט.</li>
		<li>הדביק את כפות הרגליים הקדמיות לתחתית הצינור החרוט באמצעות סרט רפואי.</li>
		<li>הניחו צינור חרוט עם עכבר על הרכב הדמיה המוגדר בזווית של 35° ומאובטח באמצעות המהדק בזווית ישרה (איור 1C).</li>
		<li>ברגע שהעכבר מאובטח בהר ההדמיה, נקה את האתר הכירורגי 3x עם סקראבס לסירוגין של קרצוף בטדין ו-70% אלכוהול איזופרופיל. שוב, בדוק שהחיה מסוממת לחלוטין.</li>
		<li>הזז את העכבר למשטח סופג נקי והצב וילון מעל העכבר כדי ליצור שדה סטרילי גדול.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הליך כירורגי
<ol><li>פתיחה של חתכים<ol>
<li>בעזרת מלקחיים עדינים, יש לאסוף את העור מיד לאוזן ימין. עם מספריים מיקרו-חיתול, לחתוך את העור מוחזק על ידי המלקחיים. הערה: ייזום ההסתעפות בשיטה המתוארת לעיל יוצר עיגול מעוגל המתאים יותר לתפירה לאחר ההליך.</li>
		<li>בצע חתך רוחבי החל מהחתירה הראשונית לכיוון האוזן השמאלית (<1 ס"מ).  לעשות חתך נוסף, החל מהחתירה הראשונית, לכיוון האף של החיה (~ 2-3 מ"מ מעבר לעין ימין).</li>
		<li>להפריד את העור מן periosteum באמצעות מלקחיים ומספריים לחתוך בעדינות דרך רקמת החיבור המפרידה את העור מן calvaria periosteum.</li>
		<li>באמצעות ספוגית כותנה סטרילית, להחיל משחה עיניים על החלק העליון של דש העור.  הרימו בעדינות את דש העור וקיפלו אותו מעל העין השמאלית. ההצטלבות של התפרים הקשתים והקורונה צריכה להיחשף בבירור (איור 1E). הערה: משחת עיניים משמשת כדי לשמור על דש העור במקום.</li>
		<li>לשטוף את המשטח הפתוח עם PBS סטרילי כדי לנקות את האזור של כל דם ושיער שיורית. הערה: במידת הצורך, יש להשתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר שערות שנותרו לאחר שטיפה, אך היזהרו שלא לפגוע בפריוסטיום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שבירה זעירה<ol>
<li>כדי ליצור שברים זעירים על calvaria, להסיר את הבוכנה של מזרק אינסולין 29 גרם לחתוך את הקצה האחורי של המזרק, סביב 300-400 סימני uL. הערה: שלב זה מקל על התמרון תחת טווח ניתוח בעת הפקת הפציעה.</li>
		<li>הניחו את קצה שיפוע (רוחב מחט אחד עד שניים) לכיוון האף מתפר הקורונה ורוחב מחט אחד עד שניים מימין לתפר הקשת (איור 1E).</li>
		<li>סובבו בעדינות את המזרק בכיוון השעון, ואז נגד כיוון השעון מספר פעמים. הערה: בעכברים צעירים, יש צורך בכמות קטנה מאוד של לחץ כלפי מטה כדי ליצור שבר מיקרו מעגלי. היזהר לא לתת המחט לחדור למוח, כמו זה יגרום לדימום ולהפריע הדמיה.</li>
		<li>השתמש במחט 27 G כדי להרחיב את המיקרו-שבר לכ-0.4 מ"מ. אם שברי העצם נשארים בשבר הזעיר, שטפו את האזור עם PBS. אם שברי העצם עדיין נשארים בשבר הזעיר, השתמשו במחט 29 גרם כדי לגרוף אותם בעדינות.</li>
		<li>חזור על שלבים 4.2.1–4.2.4 כדי ליצור פציעה בצד שמאל של התפר הסגיטלי. הערה: בשלב זה, ישנן שתי אפשרויות: 1) המשך מיד לטיפול CCL5 (סעיף 4.3) והדמיה (סעיף 5); או 2) לסגור את האתר הכירורגי בעקבות הניתוחים שלאחר הניתוח בסעיף 6. בשעה 24 שעות מאוחר יותר, להרדים את העכבר שוב, לפתוח מחדש את המראה הכירורגי, לטפל בפציעה עם CCL5 (סעיף 4.3), ולבצע הדמיה תוך-וינטלית (סעיף 5) וטיפול לאחר הניתוח (סעיף 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>טיפול CCL5<ol>
<li>מתוך מלאי של RANTES (100 ננוגרם / מ"ל), להפוך פתרון של 10 ננוגרם / מ"ל באמצעות מטריצת קרום המרתף (טבלת חומרים). שמור את הפתרון הזה על קרח כדי לשמור על המטריצה בצורה נוזלית.</li>
		<li>לטפל בכל פציעה עם 2 μL של CCL5 (10 ng/ μL) באמצעות 2-20 μL pipette (קצה פיפטה זה יש קוטר גדול יותר, וזה יעיל יותר בעת שימוש בנוזל צמיג). אפשר למטריצה להתגבש.</li>
		<li>לאחר המטריצה התגבשה, לכסות בעדינות את הקלבריה עם דש העור כדי להבטיח את הרקמה לא להתייבש. דגירה במשך שעה אחת לפני ההדמיה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. הדמיה תוך-ויאלית
<ol><li>הגדרות מיקרוסקופ<ol>
<li>הפעל את הלייזר המולטי-פוטוני (לייזר טיטניום-ספיר פמטו-שניות). הגדר את אורך הגל ל- 880 ננומטר והתאם את העוצמה להדמיית הדור ההרמוני השני (SHG) (440 ננומטר) של העצם.</li>
		<li>הפעל את לייזרי מצב מוצק 488 ננומטר ו 561 ננומטר עבור עירור של תאים GFP- ו tdTomato מבטאים, בהתאמה.</li>
		<li>הפעל גלאי PMT (פוטומוליפלייר) עבור הדור ההרמוני השני (זיהוי 405-455 ננומטר) ו- GFP (זיהוי 505-550 ננומטר). הפעל את גלאי HyD 3 לעגבניות (זיהוי 590-620 ננומטר).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הרכבה<ol>
<li>לפני העברת העכבר לטווח, בדוק את המישור החזותי של הקלבריה על-ידי לחיצה עדינה על החלק האחורי של ראש העכבר. אם המישור אינו מאוזן, התאם את המיקום על-ידי סיבוב עדין של ריסון העכבר שמאלה או ימינה. הערה: זהו צעד קריטי כדי להבטיח איכות תמונה מספקת.</li>
		<li>יש למרוח סטרילי 2% מתיל צלולוז במים (w/v) כדי לכסות את כל הקלבריה ואת דש העור ולמנוע ייבוש של הרקמה.</li>
		<li>מקם את העכבר על שלב המיקרוסקופ הממונע בציר XYZ (איור 1G). באמצעות האור האפיפלואורסצנטי, יישר את העכבר כך 1) הוא פונה למיקרוסקופ ו -2) הצומת של התפרים קורונליים וזרעיים היא נקודת ההתייחסות המרכזית של הבמה.</li>
		<li>הניחו את כיסוי הזכוכית באזור ההדמיה ובדקו שוב את היישור (איור 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדמיה לשגות זמן<ol>
<li>השתמש בעדשת הגדלה נמוכה (יעד טבילת מים 25x עם NA = 0.95) כדי לסרוק את הקלבריה. רכשו תמונת התייחסות של צומת התפר הקשת והקורונל.</li>
		<li>בעזרת אותות SHG ופלואורסצנטיים מהתאים, אתר כל מראה פציעה ותיעד את קואורדינטות XYZ, כמו גם את המרחקים מהתפרים הקשים והקורונליים (איור 2B).</li>
		<li>בחר מיקום על התפרים קורונליים או קשתיים להדמיה ארוכת טווח. קח תמונת Z-stack מפורטת של אזור זה מההפניה במהלך ההדמיה. הערה: מכיוון התפרים מייצגים נישה ידועה P-SSC, זה המקום שבו התאים יהיו נודדים בתגובה לפציעת calvaria.</li>
		<li>השתמש בהגדרות התוכנה של זמן לשגות כדי להקליט תמונה כל דקה אחת לפחות שעה. בזמן שבין תמונות, השווה את שדה התצוגה הנוכחי לשדה התצוגה ההתחלתי. אם הם שונים, השתמש בתמונת מחסנית Z כדי לקבוע לאיזה כיוון יש להתאים את שדה הראייה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. טיפול בבעלי חיים לאחר הניתוח
<ol><li>לאחר הדמיה, לשטוף את calvaria חשוף עם PBS סטרילי כדי להסיר את methylcellulose.</li>
	<li>כדי לסגור את ההסתעפות, מניחים בעדינות את דש העור מעל הקלבריה. השתמש דגימות כותנה סטריליות כדי להסיר משחה עיניים שיורית ולייבש את אתר ההסתה.</li>
	<li>באמצעות ניילון monofilament 5-0 גודל תפרים שאינם ניתנים לעריבה עם מחט חיתוך הפוך C-1 מחובר, לסגור את האתר הכירורגי. השתמש ספוגית כותנה סטרילית כדי להחיל משחה אנטיביוטית משולשת על הסגירה. הערה: הצלקות מופחתות עם טכניקות תפירה באיכות גבוהה ודימום מינימלי.</li>
	<li>מניחים את העכבר בכלוב נקי על משטח חם ולבדוק כל 15 דקות עד recumbency החזה מושגת.</li>
	<li>לתת מנה שנייה של בופרנורפין שחרור מתמשך 72 שעות לאחר הניתוח.</li>
	<li>יש לנטר מדי יום התנהגות מצטופפת, פרווה וולאנים ו/או חוסר אמביציה עד להסרת תפרים (כשבוע אחד).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+mechanisms+and+interventions.">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li><li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture.">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li><li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration.">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li><li>Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+periosteum+for+skeletal+regeneration:+the+stem+cell+that+lies+beneath.">Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath.</a> Bone. 70, 10-18 (2015).</li><li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin.">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).</li><li>Olivos-Meza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+of+periosteum+with+TGF-beta1+in+situ+enhances+the+quality+of+osteochondral+tissue+regenerated+from+transplanted+periosteal+grafts+in+adult+rabbits.">Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).</li><li>Debnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+periosteal+stem+cell+mediating+intramembranous+bone+formation.">Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation.</a> Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).</li><li>Ransom, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axin2-expressing+cells+execute+regeneration+after+skeletal+injury.">Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury.</a> Scientific Reports. 6, 36524 (2016).</li><li>Ouyang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prx1+and+3.2kb+Col1a1+promoters+target+distinct+bone+cell+populations+in+transgenic+mice.">Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice.</a> Bone. 58, 136-145 (2013).</li><li>Wilk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Calvarial+Skeletal+Stem+Cells+Expressing+PRX1+Reside+Exclusively+in+the+Calvarial+Sutures+and+Are+Required+for+Bone+Regeneration.">Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).</li><li>Ortinau, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Functionally+Distinct+Mx1+alphaSMA++Periosteal+Skeletal+Stem+Cells.">Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).</li><li>Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+gene+expression+identifies+distinct+molecular+signatures+of+bone+marrow-+and+periosteal-skeletal+stem/progenitor+cells.">Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).</li><li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+during+fracture+repair:+The+cellular+picture.">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+identifies+osteogenic+progenitors+for+bone+formation+and+fracture+repair.">Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).</li><li>Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin-receptor-expressing+mesenchymal+stromal+cells+represent+the+main+source+of+bone+formed+by+adult+bone+marrow.">Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).</li><li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells.">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+marrow+MSCs+are+dynamic,+fate-restricted+participants+in+bone+maintenance+and+regeneration.">Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).</li><li>Nitzsche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+MSC+Adhesion+Cascade-Insights+into+Homing+and+Transendothelial+Migration.">Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration.</a> Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).</li><li>Adler, J., Pagakis, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+image+distortions+due+to+temperature-related+microscope+stage+drift.">Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift.</a> Journal of Microscopy. 210, 131-137 (2003).</li><li>Roberts, S. J., Ke, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anabolic+Strategies+to+Augment+Bone+Fracture+Healing.">Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing.</a> Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).</li></ol>

L.C.O. ו- D.P. לחשוף פטנט תלוי ועומד שכותרתו "תאי גזע שלד Periosteal בתיקון עצם" (BAYM. P0264US. פ1). המחברים הנותרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

במהלך ריפוי העצם, תאי periosteal הם המקור העיקרי של כונדרוציטים מובחנים חדשים אוסטאובלסטים בתוך יבלת פציעה3. בדומה מוח עצם, SSCs osteogenic / chondrogenic זוהו גם periosteum4,5,6. הערכת מאפיינים פונקציונליים P-SSC אנדוגני הוא מאתגר מבחינה טכנית. לעתים ק?...

תיקון שבר הוא תהליך דינמי, רב תאי, השונה מהתפתחות השלד העוברי ושיפוץ. במהלך תהליך זה, אינדוקציה של אותות פגיעה מרקמה פגומה מלווה גיוס מהיר, התפשטות, ובידול לאחר מכן של תאי גזע שלד / אבות, אשר כולם קריטיים ליציבות הכוללת קיבוע של שברים1. בפרט, שלבים מוקדמים של ריפוי שבר דורשים היווצרות קדנציה רכה, המיוחסת בעיקר לתאים תושב periosteal2. כאשר העצמות נפגעות, תת-קבוצה של תאי פריוסטאלי מגיבים במהירות ותורמים לסחוסים מובחנים חדשים ומתווכים אוסטאובלסטים בתוך היבלת3, מה שמסבך את נוכחותה של אוכלוסיית תאי גזע שלד/אבות מובהקת בתוך periosteum. לכן, הזיהוי והאפיון התפקודי של תאי גזע השלד (SSCs) המקומיים פריוסטאום מהווים גישה טיפולית מבטיחה למחלות עצם ניווניות ופגמים בעצמות4.
SSCs נחשבים להתגורר במקומות רקמות מרובים, כולל מח העצם. בדומה מוח עצם, SSCs osteogenic / chondrogenic זוהו גם periosteum4,5,6.  אלה pc periosteal (P-SSCs) ניתן לתייג עם סמני שושלת מזנכימלית מוקדמת (כלומר, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7, ו Axin2-CreER8) במהלך התפתחות עצם עובר4,7,8,9,10. מגבלה משמעותית של מודלים אלה של מעקב אחר שושלת גנטית אחת היא שיש הטרוגניות משמעותית באוכלוסיות תאים מסומנות. יתר על כן, הם לא יכולים להבחין SSCs מתויגים מן צאצאיהם ב vivo. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו לאחרונה עכבר כתב כפול (Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) כדי לדמיין באופן ברור P-SSCs מ- SSCs מח עצם (BM-SSCs)11. עם דגם זה, נקבע כי P-SSCs מסומנים על ידי Mx1 + αSMA + תיוג כפול, בעוד תאים Mx1 + מובחנים יותר שוכנים במח העצם, משטחים אנדוסטאליים ופריוסטיליים, ועצמות קליפת המוח והטראבולר11,12.
ציטוקינים מרובים וגורמי גדילה ידועים לווסת שיפוץ ותיקון עצם נבדקו עבור שיפור של תיקון שלד פגמים מגזר קריטי1,13. עם זאת, בשל המורכבות התאית של מודלים פגיעה שנוצר באמצעות שיבוש המחסום הפיזי של תא העצם, ההשפעות הישירות של מולקולות אלה על נדידת P-SSC אנדוגני והפעלה במהלך הריפוי אינם ברורים. המאפיינים התפקודיים ודינמיקת הנדידה של SSCs מוערכים לעתים קרובות במבחנה על ידי ביצוע בדיקות טרנסוול או שריטה, בשילוב עם ציטוקינים או גורמי גדילה הידועים כמזינים הגירה באוכלוסיות תאים אחרות. לכן, פרשנות של תוצאות אלה ניסויים במבחנה ליישום במערכות vivo המקבילות שלהם הוא מאתגר. נכון לעכשיו, בהערכת vivo של נדידת גזע שלד / אבות לא נצפתה בדרך כלל בזמן אמת; במקום זאת, הוא נמדד בנקודות זמן קבועות לאחר שבר5,7,14,15,16.
מגבלה של שיטה זו היא שההעברה אינה מוערכת ברמה של תא בודד; במקום זאת, הוא נמדד באמצעות שינויים באוכלוסיות התאים. בשל ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופיה תוך-וינטלית של בעלי חיים חיים ויצירת עכברי כתבים נוספים, מעקב ויוו אחר תאים בודדים אפשרי כעת. באמצעות מיקרוסקופיה תוך-ויאלית חיה של בעלי חיים, ראינו את הנדידה המובהקת של P-SSCs מנישת התפר קלבריה לפגיעה בעצמות בתוך 24-48 שעות לאחר פגיעה בעכברים Mx1/Tomato/αSMA-GFP.
CCL5/CCR5 זוהה לאחרונה כמנגנון רגולטורי המשפיע על גיוס והפעלה P-SSCs במהלך התגובה לפציעה מוקדמת. מעניין, לא היה זיהוי של הגירה P-SSC משמעותית בתגובה לפציעה בזמן אמת. עם זאת, טיפול בפציעה עם CCL5 מייצר הגירה חזקה ומובהקת לכיוון של P-SSCs, אשר ניתן ללכוד בזמן אמת. לכן, מטרת פרוטוקול זה היא לספק מתודולוגיה מפורטת להקלטת נדידת in vivo של P-SSCs בזמן אמת לאחר הטיפול עם CCL5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="719">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">&#189;&#8221; optical post</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:135px;">TR2</td>
			<td style="width:247px;">For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">27G needle</td>
			<td style="width:175px;">BD PercisionGlide</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">29G insulin syringe</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>102-SN05C905P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">50 mL conicol tube</td>
			<td style="width:175px;">Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>For mouse restraint</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Adjustable angle plate</td>
			<td style="width:175px;">Renishaw</td>
			<td>R-PCA-5023-50-20</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:175px;">Coviden</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">betadine surgical scrub</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Buprenorphine SR-LAB</td>
			<td style="width:175px;">ZooPharm</td>
			<td></td>
			<td>1mg/mL Sustained Release</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Combo III</td>
			<td style="width:175px;">Obtained from staff veterinarian</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:247px;">37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Coverslip</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td>24 x 40 premium superslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Fine tip forcepts</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Ketamine</td>
			<td style="width:175px;">KetaVed</td>
			<td>50989-161-06</td>
			<td style="width:247px;">100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td>
			<td style="width:175px;">Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Matrigel</td>
			<td style="width:175px;">R &#38; D Systems</td>
			<td>344500101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:164px;">Medical tape</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>100199</td>
			<td>3&#34; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Methocellulose</td>
			<td style="width:175px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Microdissection scissors</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>1456-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:175px;">Anaheim automation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Needle holder</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Nonabsorbable sutures</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>S913BX</td>
			<td style="width:247px;">monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Rugby</td>
			<td>0536-1086-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">RANTES</td>
			<td style="width:175px;">Biolegend</td>
			<td>594202</td>
			<td>10 &#181;g/50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Right-angle clamp for &#189;&#8221; post, 3/16&#8221; Hex</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Spring-loaded 3/16&#8221; Hex-locking &#188;&#8221; thumbscrew</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>TS25H</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile cotton swabs</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>100-9249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile DPBS (1x)</td>
			<td style="width:175px;">Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:164px;">Sterile drapes</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>25-517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Surgical gloves</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>3158VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Triple antibiotic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td>
			<td>51672-2120-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">REF 367298</td>
			<td style="width:247px;">25G butterfly needle infusion set with 12&#34; tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

תאי גזע שלד periosteal (P-SSCs) חיוניים לתחזוקה ותיקון עצם לכל החיים, מה שהופך אותם למוקד אידיאלי לפיתוח טיפולים כדי לשפר את ריפוי שבר.  תאי periosteal במהירות נודדים לפציעה כדי לספק כונדרוציטים חדשים osteoblasts לריפוי שבר. באופן מסורתי, היעילות של ציטוקינים כדי לגרום לנדידת תאים נערכה רק במבחנה על ידי ביצוע transwell או שריטה. עם התקדמות במיקרוסקופיה תוך-וינטלית באמצעות עירור מולטי-פוטונים, לאחרונה התגלה כי 1) P-SSCs מבטאים את הגן הנודד CCR5 ו-2) טיפול בליגנד CCR5 המכונה CCL5 משפר את ריפוי השברים ואת ההעברה של מחשבי P-SSCs בתגובה ל- CCL5. תוצאות אלה נלכדו בזמן אמת. מתואר כאן פרוטוקול כדי לדמיין נדידת P-SSC מן נישה שלד תפר עגל (SSC) נישה כלפי פציעה לאחר טיפול עם CCL5. הפרוטוקול מפרט את בנייתו של ריסון עכבר והר הדמיה, הכנה כירורגית של קלבריה העכבר, אינדוקציה של פגם קלבריה, ורכישת הדמיה לשגות זמן.

אבות השלד הוצעו להיות בעלי פוטנציאל נודד או במחזור הדם20. לאחרונה, Mx1-Cre +Rosa26-עגבניות +α SMA-GFP+ (Mx1/עגבניות/αSMA-GFP) נוצרו עכברים כתב, שבו P-SSCs מסומנים על ידי Mx1 + α SMA + תיוג כפול (איור 2A, B). העברה משמע...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice at JoVE.com

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.

הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K Views.  Baylor College of Medicine. פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.

Video: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...