Name: real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice
Uploaded: 2020-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מחלות העצמות של פרס טקסס, פרס קרן החוק קרוליין וויז, ואת NIAMS של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרס R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 ל- D.P.  אנו מודים ל- M.E. Dickinson ות.ג'יי וודאקאן בהדמיה אופטית BCM וליבת מיקרוסקופיה חיונית וליבות הטכנולוגיה המתקדמת BCM במימון NIH (AI036211, CA125123 ו- DK056338).
.

כל העכברים נשמרו בתנאים נטולי פתוגנים, וכל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכללת ביילור לרפואה (IACUC).
1. הכנת עכבר
<ol><li>קרוס Mx1-Cre17 ו-Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (טום)18 עכברים (שנרכשו ממעבדת ג'קסון) עם עכברי αSMA-GFP (מסופקים כאן על ידי ד"ר איבו קלג'זיץ' והנרי קרוננברג) כדי ליצור עכברי Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) עכברים (איור 2A).</li>
	<li>עבור אינדוקציה Mx1-Cre, להזריק עכברים עם 25 מ"ג/ק"ג pIpC כל יומיים במשך 10 ימים.</li>
	<li>עכברים הקרנה עם 9.5 Gy יום אחד לפני השתלה תוך ורידי של 1 x 106 תאים מונונוקלאריים של מח עצם שלם מעכברי C57BL/6 מסוג בר (WT-BMT)19.</li>
	<li>לאחר 6 עד 8 שבועות של התאוששות, עכברי נושא להדמיית in vivo של פרוטוקול העברת תאים periosteal המתואר להלן. הערה: הקרנה ו- WT-BMT של עכברי Mx1-Cre נחוצים כדי לחסל תאים hematopoietic בשם Mx1 אנדוגני שעלולים להגיב לפציעה. שישה עד שמונה שבועות לאחר ההקרנה, ספירת התאים ההמטו-מואטיאטיים של המארח עומדת על <5% ולכן מוכנה להדמיה19.</li>
</ol>2. ריסון עכבר והרכבה הדמיה
<ol><li>צור ריסון עכבר באמצעות צינור חרוט 50 מ"ל (איור 1A).<ol>
<li>באמצעות מספריים מחודדים, לתקוע חור דרך החלק התחתון של החרוט. חותכים מהחור התחתון לחלק העליון של החרוט (הצד החתוך יהיה החלק העליון של האיפוק).</li>
		<li>בצעו חתך באורך של כ-4-5 ס"מ במקביל לחתך הקודם ובחצי הדרך למטה (כ-2 ס"מ) מראש האיפוק. הסר קטע זה של החרוט וחלק את הקצוות היו נחוצים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בנה הרכב הדמיה של צינור חרוט באמצעות צלחת זווית מתכווננת, עמוד אופטי בגודל 0.5 אינץ' ומהדק בזווית ישרה עבור עמוד בגודל 0.5 אינץ', "0.1875 Hex (איור 1B וטבלת חומרים).<ol>
<li>התאם את לוח הזווית לזווית של 35°. בצד שמאל של צלחת הזווית, בורג את ההודעה האופטית לתוך החור השני מהחלק האחורי של הצלחת.</li>
		<li>בצד ימין של הלוח המתכוונן, הכנס חורים 0.1875 אינץ' משושלים 0.25 אינץ' לחור השני מהחזית וחורים אחרונים על הצלחת. המהדק בזווית ישרה ישמש עם העמוד האופטי כדי לאבטח את ריסון העכבר החרוט במקום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הליך כירורגי טרום ניתוחי
<ol><li>הרדמה של עכבר<ol>
<li>לטיפול בכאב, הזריקו לעכבר באופן תת עורי בופרנורפין שחרור מתמשך (1 מ"ג/ק"ג ב"ג) 30-60 דקות לפני הניתוח.</li>
		<li>עכברי מורדמים באמצעות שילוב CCM מכרסם III (משולב III) הרדמה המכילה 37.5 מ"ג / מ"ל קטמין, 1.9 מ"ג / מ"ל קסילאסין, ו 0.37 מ"ג / מ"ל acepromazine. המינון המתאים לעכברים הוא 0.75-1.50 מ"ל לכל 1 ק"ג של משקל גוף. המינון יימשך 30-45 דקות.</li>
		<li>לאחר העכבר הוא מרדים, להחיל משחה עיניים על העיניים עם צמר גפן סטרילי כדי למנוע התייבשות העין.</li>
		<li>להדמיה ארוכת טווח (>45 דקות), יש לבצע הרדמה שוב כדי לשמור על עומק הרדמה תקין כדלקמן.<ol>
<li>הכן מזרק 1 מ"ל עם כמות מספקת של משולב III כדי לשמור על הרדמה למשך ההדמיה המתוכננת (0.75 מ"ל / קילוגרם BW לכל 30 דקות של סם נוסף). חברו 25 גרם עירוי מחט פרפר עם צינורות בגודל 12 אינץ' למזרק ודחוף חומר הרדמה דרך הצינורות והמחט.</li>
			<li>הכנס את מחט הפרפר תוך-איטרא-איטרהוני, ואז תדביק את המחט במקומה. הערה: כך ינוהל המשולבת הנוספת III במהלך ההדמיה כך שאין צורך להזיז את החיה או לשבש את מישור הראייה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ספק תמיכה תרמית עם כרית חימום שנשמרה ב 37°C לאורך כל ההליך. להדמיה ממושכת (>1 שעות) יהיה צורך בתמיכה נוספת בנוזלים.  נוזלים משלימים ניתן לספק I.P. עם Combo III נוסף במהלך הדמיה או 33 מ"ל / קילוגרם מלוחים (0.9 NaCl) תת עורית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ריסון העכבר והכנת האתר הכירורגי<ol>
<li>השתמש קוצץ כדי להסיר שיער רב ככל האפשר מהחלק העליון של הראש. יש למרוח קרם דפילטורי על האזור המגולח כדי להסיר את כל השיער שנותר באתר הניתוח.</li>
		<li>ודא שהעכבר הוא מרדים לחלוטין על ידי חוסר תגובה צביטות בוהן. לאחר 15 דקות, אם העכבר אינו מרדים לחלוטין, לנהל מנה קטנה שנייה של משולב III (<0.75 מ"ל / קילוגרם BW).</li>
		<li>מניחים את העכבר בזנב האיפוק תחילה, מחליקים אותו מספיק אחורה כך שהאף תלוי מעט על קצה החרוט.</li>
		<li>הדביק את כפות הרגליים הקדמיות לתחתית הצינור החרוט באמצעות סרט רפואי.</li>
		<li>הניחו צינור חרוט עם עכבר על הרכב הדמיה המוגדר בזווית של 35° ומאובטח באמצעות המהדק בזווית ישרה (איור 1C).</li>
		<li>ברגע שהעכבר מאובטח בהר ההדמיה, נקה את האתר הכירורגי 3x עם סקראבס לסירוגין של קרצוף בטדין ו-70% אלכוהול איזופרופיל. שוב, בדוק שהחיה מסוממת לחלוטין.</li>
		<li>הזז את העכבר למשטח סופג נקי והצב וילון מעל העכבר כדי ליצור שדה סטרילי גדול.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הליך כירורגי
<ol><li>פתיחה של חתכים<ol>
<li>בעזרת מלקחיים עדינים, יש לאסוף את העור מיד לאוזן ימין. עם מספריים מיקרו-חיתול, לחתוך את העור מוחזק על ידי המלקחיים. הערה: ייזום ההסתעפות בשיטה המתוארת לעיל יוצר עיגול מעוגל המתאים יותר לתפירה לאחר ההליך.</li>
		<li>בצע חתך רוחבי החל מהחתירה הראשונית לכיוון האוזן השמאלית (<1 ס"מ).  לעשות חתך נוסף, החל מהחתירה הראשונית, לכיוון האף של החיה (~ 2-3 מ"מ מעבר לעין ימין).</li>
		<li>להפריד את העור מן periosteum באמצעות מלקחיים ומספריים לחתוך בעדינות דרך רקמת החיבור המפרידה את העור מן calvaria periosteum.</li>
		<li>באמצעות ספוגית כותנה סטרילית, להחיל משחה עיניים על החלק העליון של דש העור.  הרימו בעדינות את דש העור וקיפלו אותו מעל העין השמאלית. ההצטלבות של התפרים הקשתים והקורונה צריכה להיחשף בבירור (איור 1E). הערה: משחת עיניים משמשת כדי לשמור על דש העור במקום.</li>
		<li>לשטוף את המשטח הפתוח עם PBS סטרילי כדי לנקות את האזור של כל דם ושיער שיורית. הערה: במידת הצורך, יש להשתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר שערות שנותרו לאחר שטיפה, אך היזהרו שלא לפגוע בפריוסטיום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שבירה זעירה<ol>
<li>כדי ליצור שברים זעירים על calvaria, להסיר את הבוכנה של מזרק אינסולין 29 גרם לחתוך את הקצה האחורי של המזרק, סביב 300-400 סימני uL. הערה: שלב זה מקל על התמרון תחת טווח ניתוח בעת הפקת הפציעה.</li>
		<li>הניחו את קצה שיפוע (רוחב מחט אחד עד שניים) לכיוון האף מתפר הקורונה ורוחב מחט אחד עד שניים מימין לתפר הקשת (איור 1E).</li>
		<li>סובבו בעדינות את המזרק בכיוון השעון, ואז נגד כיוון השעון מספר פעמים. הערה: בעכברים צעירים, יש צורך בכמות קטנה מאוד של לחץ כלפי מטה כדי ליצור שבר מיקרו מעגלי. היזהר לא לתת המחט לחדור למוח, כמו זה יגרום לדימום ולהפריע הדמיה.</li>
		<li>השתמש במחט 27 G כדי להרחיב את המיקרו-שבר לכ-0.4 מ"מ. אם שברי העצם נשארים בשבר הזעיר, שטפו את האזור עם PBS. אם שברי העצם עדיין נשארים בשבר הזעיר, השתמשו במחט 29 גרם כדי לגרוף אותם בעדינות.</li>
		<li>חזור על שלבים 4.2.1–4.2.4 כדי ליצור פציעה בצד שמאל של התפר הסגיטלי. הערה: בשלב זה, ישנן שתי אפשרויות: 1) המשך מיד לטיפול CCL5 (סעיף 4.3) והדמיה (סעיף 5); או 2) לסגור את האתר הכירורגי בעקבות הניתוחים שלאחר הניתוח בסעיף 6. בשעה 24 שעות מאוחר יותר, להרדים את העכבר שוב, לפתוח מחדש את המראה הכירורגי, לטפל בפציעה עם CCL5 (סעיף 4.3), ולבצע הדמיה תוך-וינטלית (סעיף 5) וטיפול לאחר הניתוח (סעיף 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>טיפול CCL5<ol>
<li>מתוך מלאי של RANTES (100 ננוגרם / מ"ל), להפוך פתרון של 10 ננוגרם / מ"ל באמצעות מטריצת קרום המרתף (טבלת חומרים). שמור את הפתרון הזה על קרח כדי לשמור על המטריצה בצורה נוזלית.</li>
		<li>לטפל בכל פציעה עם 2 μL של CCL5 (10 ng/ μL) באמצעות 2-20 μL pipette (קצה פיפטה זה יש קוטר גדול יותר, וזה יעיל יותר בעת שימוש בנוזל צמיג). אפשר למטריצה להתגבש.</li>
		<li>לאחר המטריצה התגבשה, לכסות בעדינות את הקלבריה עם דש העור כדי להבטיח את הרקמה לא להתייבש. דגירה במשך שעה אחת לפני ההדמיה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. הדמיה תוך-ויאלית
<ol><li>הגדרות מיקרוסקופ<ol>
<li>הפעל את הלייזר המולטי-פוטוני (לייזר טיטניום-ספיר פמטו-שניות). הגדר את אורך הגל ל- 880 ננומטר והתאם את העוצמה להדמיית הדור ההרמוני השני (SHG) (440 ננומטר) של העצם.</li>
		<li>הפעל את לייזרי מצב מוצק 488 ננומטר ו 561 ננומטר עבור עירור של תאים GFP- ו tdTomato מבטאים, בהתאמה.</li>
		<li>הפעל גלאי PMT (פוטומוליפלייר) עבור הדור ההרמוני השני (זיהוי 405-455 ננומטר) ו- GFP (זיהוי 505-550 ננומטר). הפעל את גלאי HyD 3 לעגבניות (זיהוי 590-620 ננומטר).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הרכבה<ol>
<li>לפני העברת העכבר לטווח, בדוק את המישור החזותי של הקלבריה על-ידי לחיצה עדינה על החלק האחורי של ראש העכבר. אם המישור אינו מאוזן, התאם את המיקום על-ידי סיבוב עדין של ריסון העכבר שמאלה או ימינה. הערה: זהו צעד קריטי כדי להבטיח איכות תמונה מספקת.</li>
		<li>יש למרוח סטרילי 2% מתיל צלולוז במים (w/v) כדי לכסות את כל הקלבריה ואת דש העור ולמנוע ייבוש של הרקמה.</li>
		<li>מקם את העכבר על שלב המיקרוסקופ הממונע בציר XYZ (איור 1G). באמצעות האור האפיפלואורסצנטי, יישר את העכבר כך 1) הוא פונה למיקרוסקופ ו -2) הצומת של התפרים קורונליים וזרעיים היא נקודת ההתייחסות המרכזית של הבמה.</li>
		<li>הניחו את כיסוי הזכוכית באזור ההדמיה ובדקו שוב את היישור (איור 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדמיה לשגות זמן<ol>
<li>השתמש בעדשת הגדלה נמוכה (יעד טבילת מים 25x עם NA = 0.95) כדי לסרוק את הקלבריה. רכשו תמונת התייחסות של צומת התפר הקשת והקורונל.</li>
		<li>בעזרת אותות SHG ופלואורסצנטיים מהתאים, אתר כל מראה פציעה ותיעד את קואורדינטות XYZ, כמו גם את המרחקים מהתפרים הקשים והקורונליים (איור 2B).</li>
		<li>בחר מיקום על התפרים קורונליים או קשתיים להדמיה ארוכת טווח. קח תמונת Z-stack מפורטת של אזור זה מההפניה במהלך ההדמיה. הערה: מכיוון התפרים מייצגים נישה ידועה P-SSC, זה המקום שבו התאים יהיו נודדים בתגובה לפציעת calvaria.</li>
		<li>השתמש בהגדרות התוכנה של זמן לשגות כדי להקליט תמונה כל דקה אחת לפחות שעה. בזמן שבין תמונות, השווה את שדה התצוגה הנוכחי לשדה התצוגה ההתחלתי. אם הם שונים, השתמש בתמונת מחסנית Z כדי לקבוע לאיזה כיוון יש להתאים את שדה הראייה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. טיפול בבעלי חיים לאחר הניתוח
<ol><li>לאחר הדמיה, לשטוף את calvaria חשוף עם PBS סטרילי כדי להסיר את methylcellulose.</li>
	<li>כדי לסגור את ההסתעפות, מניחים בעדינות את דש העור מעל הקלבריה. השתמש דגימות כותנה סטריליות כדי להסיר משחה עיניים שיורית ולייבש את אתר ההסתה.</li>
	<li>באמצעות ניילון monofilament 5-0 גודל תפרים שאינם ניתנים לעריבה עם מחט חיתוך הפוך C-1 מחובר, לסגור את האתר הכירורגי. השתמש ספוגית כותנה סטרילית כדי להחיל משחה אנטיביוטית משולשת על הסגירה. הערה: הצלקות מופחתות עם טכניקות תפירה באיכות גבוהה ודימום מינימלי.</li>
	<li>מניחים את העכבר בכלוב נקי על משטח חם ולבדוק כל 15 דקות עד recumbency החזה מושגת.</li>
	<li>לתת מנה שנייה של בופרנורפין שחרור מתמשך 72 שעות לאחר הניתוח.</li>
	<li>יש לנטר מדי יום התנהגות מצטופפת, פרווה וולאנים ו/או חוסר אמביציה עד להסרת תפרים (כשבוע אחד).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+mechanisms+and+interventions.">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li><li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture.">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li><li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration.">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li><li>Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+periosteum+for+skeletal+regeneration:+the+stem+cell+that+lies+beneath.">Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath.</a> Bone. 70, 10-18 (2015).</li><li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin.">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).</li><li>Olivos-Meza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+of+periosteum+with+TGF-beta1+in+situ+enhances+the+quality+of+osteochondral+tissue+regenerated+from+transplanted+periosteal+grafts+in+adult+rabbits.">Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).</li><li>Debnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+periosteal+stem+cell+mediating+intramembranous+bone+formation.">Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation.</a> Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).</li><li>Ransom, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axin2-expressing+cells+execute+regeneration+after+skeletal+injury.">Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury.</a> Scientific Reports. 6, 36524 (2016).</li><li>Ouyang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prx1+and+3.2kb+Col1a1+promoters+target+distinct+bone+cell+populations+in+transgenic+mice.">Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice.</a> Bone. 58, 136-145 (2013).</li><li>Wilk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Calvarial+Skeletal+Stem+Cells+Expressing+PRX1+Reside+Exclusively+in+the+Calvarial+Sutures+and+Are+Required+for+Bone+Regeneration.">Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).</li><li>Ortinau, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Functionally+Distinct+Mx1+alphaSMA++Periosteal+Skeletal+Stem+Cells.">Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).</li><li>Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+gene+expression+identifies+distinct+molecular+signatures+of+bone+marrow-+and+periosteal-skeletal+stem/progenitor+cells.">Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).</li><li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+during+fracture+repair:+The+cellular+picture.">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+identifies+osteogenic+progenitors+for+bone+formation+and+fracture+repair.">Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).</li><li>Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin-receptor-expressing+mesenchymal+stromal+cells+represent+the+main+source+of+bone+formed+by+adult+bone+marrow.">Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).</li><li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells.">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+marrow+MSCs+are+dynamic,+fate-restricted+participants+in+bone+maintenance+and+regeneration.">Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).</li><li>Nitzsche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+MSC+Adhesion+Cascade-Insights+into+Homing+and+Transendothelial+Migration.">Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration.</a> Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).</li><li>Adler, J., Pagakis, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+image+distortions+due+to+temperature-related+microscope+stage+drift.">Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift.</a> Journal of Microscopy. 210, 131-137 (2003).</li><li>Roberts, S. J., Ke, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anabolic+Strategies+to+Augment+Bone+Fracture+Healing.">Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing.</a> Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).</li></ol>

L.C.O. ו- D.P. לחשוף פטנט תלוי ועומד שכותרתו "תאי גזע שלד Periosteal בתיקון עצם" (BAYM. P0264US. פ1). המחברים הנותרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

במהלך ריפוי העצם, תאי periosteal הם המקור העיקרי של כונדרוציטים מובחנים חדשים אוסטאובלסטים בתוך יבלת פציעה3. בדומה מוח עצם, SSCs osteogenic / chondrogenic זוהו גם periosteum4,5,6. הערכת מאפיינים פונקציונליים P-SSC אנדוגני הוא מאתגר מבחינה טכנית. לעתים ק?...

תיקון שבר הוא תהליך דינמי, רב תאי, השונה מהתפתחות השלד העוברי ושיפוץ. במהלך תהליך זה, אינדוקציה של אותות פגיעה מרקמה פגומה מלווה גיוס מהיר, התפשטות, ובידול לאחר מכן של תאי גזע שלד / אבות, אשר כולם קריטיים ליציבות הכוללת קיבוע של שברים1. בפרט, שלבים מוקדמים של ריפוי שבר דורשים היווצרות קדנציה רכה, המיוחסת בעיקר לתאים תושב periosteal2. כאשר העצמות נפגעות, תת-קבוצה של תאי פריוסטאלי מגיבים במהירות ותורמים לסחוסים מובחנים חדשים ומתווכים אוסטאובלסטים בתוך היבלת3, מה שמסבך את נוכחותה של אוכלוסיית תאי גזע שלד/אבות מובהקת בתוך periosteum. לכן, הזיהוי והאפיון התפקודי של תאי גזע השלד (SSCs) המקומיים פריוסטאום מהווים גישה טיפולית מבטיחה למחלות עצם ניווניות ופגמים בעצמות4.
SSCs נחשבים להתגורר במקומות רקמות מרובים, כולל מח העצם. בדומה מוח עצם, SSCs osteogenic / chondrogenic זוהו גם periosteum4,5,6.  אלה pc periosteal (P-SSCs) ניתן לתייג עם סמני שושלת מזנכימלית מוקדמת (כלומר, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7, ו Axin2-CreER8) במהלך התפתחות עצם עובר4,7,8,9,10. מגבלה משמעותית של מודלים אלה של מעקב אחר שושלת גנטית אחת היא שיש הטרוגניות משמעותית באוכלוסיות תאים מסומנות. יתר על כן, הם לא יכולים להבחין SSCs מתויגים מן צאצאיהם ב vivo. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו לאחרונה עכבר כתב כפול (Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) כדי לדמיין באופן ברור P-SSCs מ- SSCs מח עצם (BM-SSCs)11. עם דגם זה, נקבע כי P-SSCs מסומנים על ידי Mx1 + αSMA + תיוג כפול, בעוד תאים Mx1 + מובחנים יותר שוכנים במח העצם, משטחים אנדוסטאליים ופריוסטיליים, ועצמות קליפת המוח והטראבולר11,12.
ציטוקינים מרובים וגורמי גדילה ידועים לווסת שיפוץ ותיקון עצם נבדקו עבור שיפור של תיקון שלד פגמים מגזר קריטי1,13. עם זאת, בשל המורכבות התאית של מודלים פגיעה שנוצר באמצעות שיבוש המחסום הפיזי של תא העצם, ההשפעות הישירות של מולקולות אלה על נדידת P-SSC אנדוגני והפעלה במהלך הריפוי אינם ברורים. המאפיינים התפקודיים ודינמיקת הנדידה של SSCs מוערכים לעתים קרובות במבחנה על ידי ביצוע בדיקות טרנסוול או שריטה, בשילוב עם ציטוקינים או גורמי גדילה הידועים כמזינים הגירה באוכלוסיות תאים אחרות. לכן, פרשנות של תוצאות אלה ניסויים במבחנה ליישום במערכות vivo המקבילות שלהם הוא מאתגר. נכון לעכשיו, בהערכת vivo של נדידת גזע שלד / אבות לא נצפתה בדרך כלל בזמן אמת; במקום זאת, הוא נמדד בנקודות זמן קבועות לאחר שבר5,7,14,15,16.
מגבלה של שיטה זו היא שההעברה אינה מוערכת ברמה של תא בודד; במקום זאת, הוא נמדד באמצעות שינויים באוכלוסיות התאים. בשל ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופיה תוך-וינטלית של בעלי חיים חיים ויצירת עכברי כתבים נוספים, מעקב ויוו אחר תאים בודדים אפשרי כעת. באמצעות מיקרוסקופיה תוך-ויאלית חיה של בעלי חיים, ראינו את הנדידה המובהקת של P-SSCs מנישת התפר קלבריה לפגיעה בעצמות בתוך 24-48 שעות לאחר פגיעה בעכברים Mx1/Tomato/αSMA-GFP.
CCL5/CCR5 זוהה לאחרונה כמנגנון רגולטורי המשפיע על גיוס והפעלה P-SSCs במהלך התגובה לפציעה מוקדמת. מעניין, לא היה זיהוי של הגירה P-SSC משמעותית בתגובה לפציעה בזמן אמת. עם זאת, טיפול בפציעה עם CCL5 מייצר הגירה חזקה ומובהקת לכיוון של P-SSCs, אשר ניתן ללכוד בזמן אמת. לכן, מטרת פרוטוקול זה היא לספק מתודולוגיה מפורטת להקלטת נדידת in vivo של P-SSCs בזמן אמת לאחר הטיפול עם CCL5.

<table><tbody><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; optical post</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G needle</td><td>BD PercisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>29G insulin syringe</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conicol tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>For mouse restraint</td></tr><tr><td>Adjustable angle plate</td><td>Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>betadine surgical scrub</td><td>Henry Schen</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1mg/mL Sustained Release</td></tr><tr><td>Combo III</td><td>Obtained from staff veterinarian</td><td>N/A</td><td>37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-545-87</td><td>24 x 40 premium superslip</td></tr><tr><td>Fine tip forcepts</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>Medical tape</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>3&quot; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td></tr><tr><td>Methocellulose</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>Anaheim automation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Nonabsorbable sutures</td><td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td></tr><tr><td>Opthalmic ointment</td><td>Rugby</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 &amp;micro;g/50 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Right-angle clamp for &amp;frac12;&amp;rdquo; post, 3/16&amp;rdquo; Hex</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Spring-loaded 3/16&amp;rdquo; Hex-locking &amp;frac14;&amp;rdquo; thumbscrew</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Sterile cotton swabs</td><td>Henry Schen</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Sterile DPBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Surgical gloves</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td><td></td></tr><tr><td>Triple antibiotic ointment</td><td>Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer blood collection set</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>25G butterfly needle infusion set with 12&quot; tubing</td></tr></tbody></table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

תאי גזע שלד periosteal (P-SSCs) חיוניים לתחזוקה ותיקון עצם לכל החיים, מה שהופך אותם למוקד אידיאלי לפיתוח טיפולים כדי לשפר את ריפוי שבר.  תאי periosteal במהירות נודדים לפציעה כדי לספק כונדרוציטים חדשים osteoblasts לריפוי שבר. באופן מסורתי, היעילות של ציטוקינים כדי לגרום לנדידת תאים נערכה רק במבחנה על ידי ביצוע transwell או שריטה. עם התקדמות במיקרוסקופיה תוך-וינטלית באמצעות עירור מולטי-פוטונים, לאחרונה התגלה כי 1) P-SSCs מבטאים את הגן הנודד CCR5 ו-2) טיפול בליגנד CCR5 המכונה CCL5 משפר את ריפוי השברים ואת ההעברה של מחשבי P-SSCs בתגובה ל- CCL5. תוצאות אלה נלכדו בזמן אמת. מתואר כאן פרוטוקול כדי לדמיין נדידת P-SSC מן נישה שלד תפר עגל (SSC) נישה כלפי פציעה לאחר טיפול עם CCL5. הפרוטוקול מפרט את בנייתו של ריסון עכבר והר הדמיה, הכנה כירורגית של קלבריה העכבר, אינדוקציה של פגם קלבריה, ורכישת הדמיה לשגות זמן.

אבות השלד הוצעו להיות בעלי פוטנציאל נודד או במחזור הדם20. לאחרונה, Mx1-Cre +Rosa26-עגבניות +α SMA-GFP+ (Mx1/עגבניות/αSMA-GFP) נוצרו עכברים כתב, שבו P-SSCs מסומנים על ידי Mx1 + α SMA + תיוג כפול (איור 2A, B). העברה משמע...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice at JoVE.com

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.

הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K Views.  Baylor College of Medicine. פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.

Video: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Neuroscience

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Medicine

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Immunology and Infection

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Biology

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video