Questo lavoro è stato supportato dal Bone Disease Program of Texas Award, dal Caroline Wiess Law Fund Award e dal NIAMS del National Institutes of Health con i numeri di premio R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 a D.P.  Ringraziamo M.E. Dickinson e T.J. Vadakkan nel BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core e nel BCM Advanced Technology Cores con finanziamenti da NIH (AI036211, CA125123 e DK056338).
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Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni prive di agenti patogeni e tutte le procedure sono state approvate dal Baylor College of Medicine's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Preparazione del mouse
<ol><li>Incrociare i mouse Mx1-Cre17 e Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 (acquistati dal Jackson Laboratory) con mouse αSMA-GFP (forniti qui dai dottori Ivo Kalajzic e Henry Kronenberg) per generare mouse reporter Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) (Figura 2A).</li>
	<li>Per l'induzione mx1-Cre, iniettare topi con 25 mg/kg di pIpC a giorni alterni per 10 giorni.</li>
	<li>Irradiare topi con 9,5 Gy 1 giorno prima del trapianto endovenoso di 1 x 106 cellule mononucleate del midollo osseo intero da topi C57BL/6 wild-type (WT-BMT)19.</li>
	<li>Dopo 6-8 settimane di recupero, i topi sono sottoposti all'imaging in vivo del protocollo di migrazione cellulare periostale descritto di seguito. NOTA: L'irradiazione e il WT-BMT dei topi Mx1-Cre sono necessari per eliminare le cellule ematopoietiche marcate endogenamente mx1 che possono rispondere a una lesione. Da sei a otto settimane dopo l'irradiazione, il numero di cellule ematopoietiche dell'ospite è al <5% e quindi pronto per l'imaging19.</li>
</ol>2. Sistema di ritenuta del mouse e supporto per immagini
<ol><li>Creare un sistema di ritenuta per mouse con un tubo conico da 50 ml (Figura 1A).<ol>
<li>Usando le forbici appuntite, fai un buco attraverso il fondo della conica. Tagliare dal foro inferiore alla parte superiore della conica (il lato tagliato sarà la parte superiore del sistema di ritenuta).</li>
		<li>Effettuare un taglio lungo circa 4-5 cm parallelo al taglio precedente e a metà strada (~ 2 cm) dalla parte superiore del sistema di ritenuta. Rimuovere questa sezione della conica e lisciare i bordi erano necessari.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Costruire un supporto per imaging a tubo conico utilizzando una piastra angolare regolabile, un palo ottico da 0,5" e un morsetto ad angolo retto per il palo da 0,5", esagonale da 0,1875" (Figura 1B e Tabella dei materiali).<ol>
<li>Regolare la piastra angolare su un angolo di 35°. Sul lato sinistro della piastra angolare, avvitare il palo ottico nel secondo foro dal retro della piastra.</li>
		<li>Sul lato destro della piastra regolabile, inserire una vite a molla da 0,1875 "con bloccaggio esagonale da 0,25" nel secondo foro dalla parte anteriore e negli ultimi fori sulla piastra. Il morsetto ad angolo retto verrà utilizzato con il montante ottico per fissare il sistema di ritenuta conica del mouse in posizione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procedura chirurgica preoperatoria
<ol><li>Anestesia del topo<ol>
<li>Per la gestione del dolore, iniettare per via sottocutanea il topo con buprenorfina a rilascio prolungato (1 mg/kg di peso corporeo) 30-60 minuti prima dell'intervento chirurgico.</li>
		<li>Anestetizzare i topi utilizzando l'anestesia di combinazione CCM III (combo III) contenente 37,5 mg / mL di ketamina, 1,9 mg / mL di xilazina e 0,37 mg / mL di acepromazina. Il dosaggio appropriato per i topi è 0,75-1,50 ml per 1 kg di peso corporeo. La dose durerà 30-45 minuti.</li>
		<li>Una volta che il topo è anestetizzato, applicare un unguento oftalmico agli occhi con un batuffolo di cotone sterile per prevenire la disidratazione degli occhi.</li>
		<li>Per l'imaging a lungo termine (>45 min), somministrare nuovamente l'anestesia per mantenere una corretta profondità anestetica come segue.<ol>
<li>Preparare una siringa da 1 mL con una quantità sufficiente di combo III per mantenere l'anestesia per la durata di imaging pianificata (0,75 ml/kg di peso corporeo per 30 minuti di sedazione aggiuntiva). Attaccare un set per infusione con ago a farfalla da 25 G con tubo da 12" alla siringa e spingere l'anestetico attraverso il tubo e l'ago.</li>
			<li>Inserire l'ago a farfalla per via intraperitoneale, quindi fissare l'ago in posizione. NOTA: questo è il modo in cui la combo III aggiuntiva verrà somministrata durante l'imaging in modo tale che non sia necessario spostare l'animale o interrompere il piano visivo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fornire supporto termico con una piastra riscaldante mantenuta a 37 ° C durante tutta la procedura. Per l'imaging prolungato (>1 ora) sarà necessario un ulteriore supporto fluido.  I liquidi supplementari possono essere forniti I.P. con Combo III aggiuntivo durante l'imaging o 33 ml / kg di soluzione salina (0,9 NaCl) per via sottocutanea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contenimento del topo e preparazione del sito chirurgico<ol>
<li>Usa i tagliacapelli per rimuovere quanti più peli possibili dalla parte superiore della testa. Applicare la crema depilatoria sulla zona rasata per rimuovere eventuali peli rimanenti nel sito chirurgico.</li>
		<li>Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato da una mancanza di risposta ai pizzichi delle dita dei piedi. Dopo 15 minuti, se il topo non è completamente anestetizzato, somministrare una seconda dose più piccola di combo III (<0,75 ml/kg di peso corporeo).</li>
		<li>Posiziona il mouse nella coda di ritenuta, facendolo scorrere abbastanza indietro in modo che il naso penda leggermente sul bordo del conico.</li>
		<li>Fissare le zampe anteriori sul fondo del tubo conico usando del nastro medico.</li>
		<li>Posizionare il tubo conico con il mouse su un supporto per immagini impostato con un angolo di 35° e fissarlo utilizzando il morsetto ad angolo retto (Figura 1C).</li>
		<li>Una volta che il mouse è al sicuro nel supporto per imaging, pulire il sito chirurgico 3 volte con scrub alternati di betadine scrub e alcool isopropilico al 70%. Ancora una volta, controlla che l'animale sia completamente sedato.</li>
		<li>Spostare il mouse su un pad assorbente pulito e posizionare un drappo sopra il mouse per creare un grande campo sterile.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Procedura chirurgica
<ol><li>Incisione di apertura<ol>
<li>Usando una pinza a punta fine, raccogliere la pelle immediatamente mediale all'orecchio destro. Con le forbici da microdissezione, tagliare la pelle trattenuta dalla pinza. NOTA: l'avvio dell'incisione con il metodo sopra descritto crea un'incisione arrotondata che è più adatta per la sutura dopo la procedura.</li>
		<li>Fare un'incisione trasversale a partire dall'incisione iniziale verso l'orecchio sinistro (<1 cm).  Fai un'altra incisione, a partire dall'incisione iniziale, verso il naso dell'animale (~ 2-3 mm oltre l'occhio destro).</li>
		<li>Separare la pelle dal periostio usando la pinza e le forbici per tagliare delicatamente il tessuto connettivo separando la pelle dalla calvaria periostio.</li>
		<li>Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, applicare un unguento oftalmico sulla parte superiore del lembo della pelle.  Raccogliere delicatamente il lembo della pelle e piegarlo sull'occhio sinistro. L'intersezione delle suture sagittale e coronale deve essere chiaramente esposta (Figura 1E). NOTA: L'unguento oftalmico viene utilizzato per mantenere il lembo della pelle in posizione.</li>
		<li>Lavare la superficie aperta con PBS sterile per pulire l'area di sangue e capelli residui. NOTA: Se necessario, utilizzare una pinza a punta fine per rimuovere i peli che rimangono dopo il lavaggio, ma fare attenzione a non danneggiare il periostio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microfrattura<ol>
<li>Per generare microfratture sulla calvaria, rimuovere lo stantuffo di una siringa da insulina da 29 G e tagliare l'estremità posteriore della siringa, intorno ai segni di 300-400 uL. NOTA: questo passaggio semplifica la manovra sotto un ambito di dissezione quando si produce la lesione.</li>
		<li>Posizionare la punta di una smussatura (da una a due larghezze dell'ago) verso il naso dalla sutura coronale e una o due larghezze dell'ago a destra della sutura sagittale (Figura 1E).</li>
		<li>Ruotare delicatamente la siringa in senso orario, quindi in senso antiorario più volte. NOTA: nei topi giovani, è necessaria una quantità molto piccola di pressione verso il basso per creare una microfrattura circolare. Fare attenzione a non lasciare che l'ago penetri nel cervello, in quanto ciò causerà sanguinamento e interferirà con l'imaging.</li>
		<li>Utilizzare un ago da 27 G per allargare la microfrattura a ~0,4 mm. Se i frammenti ossei rimangono nella microfrattura, lavare l'area con PBS. Se i frammenti ossei rimangono ancora nella microfrattura, utilizzare l'ago da 29 G per estrarli delicatamente.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 4.2.1–4.2.4 per creare una lesione sul lato sinistro della sutura sagittale. NOTA: A questo punto, ci sono due opzioni: 1) procedere immediatamente al trattamento con CCL5 (paragrafo 4.3) e all'imaging (paragrafo 5); o 2) chiudere il sito chirurgico seguendo le procedure postoperatorie di cui al paragrafo 6. A 24 ore dopo, anestetizzare nuovamente il topo, riaprire la vista chirurgica, trattare la lesione con CCL5 (paragrafo 4.3) ed eseguire l'imaging intravitale (paragrafo 5) e l'assistenza postoperatoria (sezione 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trattamento CCL5<ol>
<li>Da uno stock di RANTES (100 ng/mL), fare una soluzione di 10 ng/mL usando la matrice della membrana basale (Tabella dei materiali). Mantenere questa soluzione su ghiaccio per mantenere la matrice in forma liquida.</li>
		<li>Trattare ogni lesione con 2 μL di CCL5 (10 ng / μL) utilizzando una pipetta da 2-20 μL (questa punta della pipetta ha un diametro maggiore, che è più efficace quando si utilizza un liquido viscoso). Permettete alla matrice di solidificarsi.</li>
		<li>Una volta che la matrice si è solidificata, coprire delicatamente la calvaria con il lembo della pelle per garantire che il tessuto non si disidrati. Incubare per 1 ora prima dell'imaging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Imaging intravitale
<ol><li>Impostazioni del microscopio<ol>
<li>Accendere il laser multifotone (laser femtosecondi titanio-zaffiro). Impostare la lunghezza d'onda su 880 nm e regolare la potenza per l'imaging di seconda generazione armonica (SHG) (440 nm) dell'osso.</li>
		<li>Accendere i laser a stato solido a 488 nm e 561 nm per l'eccitazione delle cellule che esprimono GFP e tdTomato, rispettivamente.</li>
		<li>Attivare i rilevatori PMT (fotomoltiplicatore a tubo) per la seconda generazione armonica (rilevamento 405-455 nm) e GFP (rilevamento 505-550 nm). Accendere il rilevatore HyD 3 per il segnale di pomodoro (rilevamento 590-620 nm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montante<ol>
<li>Prima di spostare il mouse sull'oscilloscopio, controllare il piano visivo della calvaria premendo delicatamente la parte posteriore della testa del mouse. Se il piano non è in piano, regolare la posizione ruotando delicatamente il sistema di ritenuta del mouse a sinistra o a destra. NOTA: questo è un passaggio fondamentale per garantire una qualità dell'immagine sufficiente.</li>
		<li>Applicare la metilcellulosa sterile al 2% in acqua (p/v) per coprire l'intera calvaria e il lembo cutaneo e prevenire l'essiccazione del tessuto.</li>
		<li>Posizionare il mouse sullo stadio del microscopio motorizzato ad asse XYZ (Figura 1G). Usando la luce epifluorescente, allineare il topo in modo che 1) sia rivolto al microscopio e 2) l'intersezione delle suture coronale e sagittale sia il punto di riferimento centrato dello stadio.</li>
		<li>Posizionare il coperchio di vetro sull'area di imaging e ricontrollare l'allineamento (Figura 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging time-lapse<ol>
<li>Utilizzare una lente a basso ingrandimento (obiettivo ad immersione in acqua 25x con NA = 0,95) per scansionare la calvaria. Acquisire un'immagine di riferimento dell'intersezione di sutura sagittale e coronale.</li>
		<li>Utilizzando l'SHG e i segnali fluorescenti delle cellule, individuare ogni vista della lesione e registrare le coordinate XYZ e le distanze dalle suture sagittali e coronali (Figura 2B).</li>
		<li>Scegli una posizione sulle suture coronali o sagittali per l'imaging a lungo termine. Scatta un'immagine Z-stack dettagliata di quest'area dal riferimento durante l'imaging. NOTA: Poiché le suture rappresentano una nicchia P-SSC nota, è da qui che le cellule migreranno in risposta alla lesione della calvaria.</li>
		<li>Utilizzare le impostazioni del software time-lapse per registrare un'immagine ogni 1 minuto per almeno 1 ora. Nel tempo tra le istantanee, confrontare il campo visivo corrente con il campo visivo iniziale. Se sono diversi, utilizzare l'immagine Z-stack per determinare in quale direzione deve essere regolato il campo visivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Cura postoperatoria degli animali
<ol><li>Dopo l'imaging, sciacquare la calvaria esposta con PBS sterile per rimuovere la metilcellulosa.</li>
	<li>Per chiudere l'incisione, posizionare delicatamente il lembo della pelle sulla calvaria. Utilizzare tamponi di cotone sterili per rimuovere l'unguento oftalmico residuo e asciugare il sito di incisione.</li>
	<li>Utilizzando suture non assorbibili in nylon monofilamento taglia 5-0 con un ago da taglio inverso C-1 collegato, chiudere il sito chirurgico. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per applicare un unguento antibiotico triplo all'incisione chiusa. NOTA: Le cicatrici sono ridotte con tecniche di sutura di alta qualità e sanguinamento minimo.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una gabbia pulita su una superficie calda e controllare ogni 15 minuti fino a quando non si raggiunge la reclinazione sternale.</li>
	<li>Somministrare una seconda dose di buprenorfina a rilascio prolungato 72 ore dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Monitorare quotidianamente il comportamento rannicchiato, la pelliccia arruffata e / o la mancanza di deambulazione fino a quando le suture non vengono rimosse (~ 1 settimana).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. 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L.C.O. e D.P. divulgano un brevetto in sospeso intitolato "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Durante la guarigione ossea, le cellule periosteali sono la principale fonte di condrociti e osteoblasti recentemente differenziati all'interno di un callo di lesione3. Analogamente al midollo osseo, anche nel perostio sono state identificate SSC osteogeniche/condrogene4,5,6. Valutare le caratteristiche funzionali endogene di P-SSC è tecnicamente impegnativo. Spesso, le dinamiche migratorie delle SSC son...

La riparazione delle fratture è un processo dinamico e multicellulare che si distingue dallo sviluppo scheletrico embrionale e dal rimodellamento. Durante questo processo, l'induzione di segnali di lesione dal tessuto danneggiato è seguita dal rapido reclutamento, proliferazione e successiva differenziazione delle cellule staminali /progenitrici scheletriche, che sono tutte fondamentali per la stabilità generale e la fissazione delle fratture1. In particolare, le prime fasi della guarigione delle fratture richiedono la formazione di callo molle, che è principalmente attribuita alle cellule residenti periosteali2. Quando le ossa sono ferite, un sottogruppo di cellule periosteali risponde rapidamente e contribuisce a nuovi intermedi cartilagineici differenziati e osteoblasti all'interno del callo3, implicando la presenza di una distinta popolazione di cellule staminali / progenitrici scheletriche all'interno del periostio. Pertanto, l'identificazione e la caratterizzazione funzionale delle cellule staminali scheletriche residenti nel periostio (SSC) costituiscono un approccio terapeutico promettente per le malattie degenerative dell'osso e i difetti ossei4.
Si ritiene che le SSC risiedano in più posizioni tissutali, incluso il midollo osseo. Analogamente al midollo osseo, anche nel perostio sono state identificate SSC osteogeniche/condrogene4,5,6.  Queste SSC periosteali (P-SSC) possono essere etichettate con marcatori di lignaggio mesenchimale precoce (ad esempio, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 e Axin2-CreER8) durante lo sviluppo osseo fetale4,7,8,9,10. Una limitazione significativa di questi singoli modelli di tracciamento del lignaggio genetico è che esiste una sostanziale eterogeneità all'interno delle popolazioni cellulari marcate. Inoltre, non sono in grado di distinguere le SSC etichettate dalla loro progenie in vivo. Per ovviare a questa limitazione, abbiamo recentemente sviluppato un mouse a doppio reporter (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) per visualizzare distintamente i P-SSC dalle SSC del midollo osseo (BM-SSC)11. Con questo modello, è stato determinato che le P-SSC sono contrassegnate dalla doppia marcatura Mx1+αSMA+, mentre le cellule Mx1+ più differenziate risiedono nel midollo osseo, nelle superfici endosteale e periostale e nelle ossa corticali e trabecolari11,12.
Citochine multiple e fattori di crescita sono noti per regolare il rimodellamento e la riparazione ossea e sono stati testati per il miglioramento della riparazione scheletrica nei difetti critici del segmento1,13. Tuttavia, a causa della complessità cellulare dei modelli di lesione generati attraverso l'interruzione della barriera fisica del compartimento osseo, gli effetti diretti di queste molecole sulla migrazione e l'attivazione endogena di P-SSC durante la guarigione non sono chiari. Le caratteristiche funzionali e le dinamiche migratorie delle SSC sono spesso valutate in vitro eseguendo un test transwell o scratch, in combinazione con citochine o fattori di crescita noti per indurre la migrazione in altre popolazioni cellulari. Pertanto, l'interpretazione dei risultati di questi esperimenti in vitro per l'applicazione nei loro corrispondenti sistemi in vivo è impegnativa. Attualmente, la valutazione in vivo della migrazione delle cellule staminali/progenitrici scheletriche non è tipicamente osservata in tempo reale; piuttosto, viene misurato in punti temporali fissi post-frattura5,7,14,15,16.
Un limite di questo metodo è che la migrazione non viene valutata a livello di singola cella; piuttosto, viene misurato attraverso i cambiamenti nelle popolazioni cellulari. A causa dei recenti progressi nella microscopia intravitale animale vivo e della generazione di topi reporter aggiuntivi, è ora possibile il monitoraggio in vivo delle singole cellule. Utilizzando la microscopia intravitale di animali vivi, abbiamo osservato la distinta migrazione delle P-SSC dalla nicchia di sutura calvariale a una lesione ossea entro 24-48 ore dopo la lesione nei topi Mx1 / Tomato / αSMA-GFP.
CCL5/CCR5 è stato recentemente identificato come un meccanismo di regolamentazione che influenza il reclutamento e l'attivazione delle P-SSC durante la risposta precoce all'infortunio. È interessante notare che non è stato rilevato alcuna migrazione P-SSC sostanziale in risposta a un infortunio in tempo reale. Tuttavia, il trattamento di una lesione con CCL5 produce una migrazione robusta e distinta direzionalmente delle P-SSC, che può essere catturata in tempo reale. Pertanto, l'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una metodologia dettagliata per registrare la migrazione in vivo di P-SSC in tempo reale dopo il trattamento con CCL5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="719">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">&#189;&#8221; optical post</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:135px;">TR2</td>
			<td style="width:247px;">For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">27G needle</td>
			<td style="width:175px;">BD PercisionGlide</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">29G insulin syringe</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>102-SN05C905P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">50 mL conicol tube</td>
			<td style="width:175px;">Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>For mouse restraint</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Adjustable angle plate</td>
			<td style="width:175px;">Renishaw</td>
			<td>R-PCA-5023-50-20</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:175px;">Coviden</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">betadine surgical scrub</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Buprenorphine SR-LAB</td>
			<td style="width:175px;">ZooPharm</td>
			<td></td>
			<td>1mg/mL Sustained Release</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Combo III</td>
			<td style="width:175px;">Obtained from staff veterinarian</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:247px;">37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Coverslip</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td>24 x 40 premium superslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Fine tip forcepts</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Ketamine</td>
			<td style="width:175px;">KetaVed</td>
			<td>50989-161-06</td>
			<td style="width:247px;">100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td>
			<td style="width:175px;">Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Matrigel</td>
			<td style="width:175px;">R &#38; D Systems</td>
			<td>344500101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:164px;">Medical tape</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>100199</td>
			<td>3&#34; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Methocellulose</td>
			<td style="width:175px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Microdissection scissors</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>1456-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:175px;">Anaheim automation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Needle holder</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Nonabsorbable sutures</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>S913BX</td>
			<td style="width:247px;">monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Rugby</td>
			<td>0536-1086-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">RANTES</td>
			<td style="width:175px;">Biolegend</td>
			<td>594202</td>
			<td>10 &#181;g/50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Right-angle clamp for &#189;&#8221; post, 3/16&#8221; Hex</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Spring-loaded 3/16&#8221; Hex-locking &#188;&#8221; thumbscrew</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>TS25H</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile cotton swabs</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>100-9249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile DPBS (1x)</td>
			<td style="width:175px;">Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:164px;">Sterile drapes</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>25-517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Surgical gloves</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>3158VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Triple antibiotic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td>
			<td>51672-2120-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">REF 367298</td>
			<td style="width:247px;">25G butterfly needle infusion set with 12&#34; tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

Le cellule staminali scheletriche periosteali (P-SSC) sono essenziali per il mantenimento e la riparazione ossea per tutta la vita, rendendole un punto focale ideale per lo sviluppo di terapie per migliorare la guarigione delle fratture.  Le cellule periosteali migrano rapidamente verso una lesione per fornire nuovi condrociti e osteoblasti per la guarigione delle fratture. Tradizionalmente, l'efficacia di una citochina per indurre la migrazione cellulare è stata condotta solo in vitro eseguendo un test transwell o scratch. Con i progressi nella microscopia intravitale utilizzando l'eccitazione multifotonica, è stato recentemente scoperto che 1) le P-SSC esprimono il gene migratore CCR5 e 2) il trattamento con il ligando CCR5 noto come CCL5 migliora la guarigione delle fratture e la migrazione delle P-SSC in risposta a CCL5. Questi risultati sono stati acquisiti in tempo reale. Qui è descritto un protocollo per visualizzare la migrazione P-SSC dalla nicchia delle cellule staminali scheletriche di sutura calvariale (SSC) verso una lesione dopo il trattamento con CCL5. Il protocollo descrive in dettaglio la costruzione di un sistema di ritenuta per topo e di un supporto per l'imaging, la preparazione chirurgica della calvaria del topo, l'induzione di un difetto di calvaria e l'acquisizione dell'imaging time-lapse.

È stato proposto che i progenitori scheletrici abbiano un potenziale migratorio o circolatorio20. Recentemente, sono stati generati mouse reporter Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), in cui i P-SSC sono contrassegnati dalla doppia etichettatura Mx1+α SMA+ (Figura 2A,B). La migrazione sostanziale di Mx1<...

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Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Questo protocollo descrive il rilevamento della migrazione delle cellule staminali scheletriche periosteali mediate da CCL5 in tempo reale utilizzando la microscopia intravitale animale vivo.

Imaging in tempo reale della migrazione indotta da CCL5 di cellule staminali scheletriche periosteali nei topi

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K Views.  Baylor College of Medicine. Questo protocollo descrive il rilevamento della migrazione delle cellule staminali scheletriche periosteali mediate da CCL5 in tempo reale utilizzando la microscopia intravitale animale vivo.

Video: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Supporto orizzontale intero: un protocollo di elaborazione e imaging novello per le sezioni trasversali tessute spesse e tridimensionali della pelle

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificazione delle cellule satelliti del muscolo scheletrico dall'immunofluorescenza con Pax7 e Laminin anticorpi

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Valutazione dei danni ossidativi nelle cellule primarie della superficie oculare del topo/cellule staminali in risposta ai danni ultravioletti-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Esecuzione di Xenografi muscolari scheletrici umani in topi immunodeficienti

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...