이 작품은 텍사스 상뼈 질환 프로그램, 캐롤라인 비스 법률 기금 상, 그리고 수상 번호 R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946에 수여 번호로 국립 보건 원의 NIAMS에 의해 지원되었다.  BCM 광학 이미징 및 바이탈 현미경 코어와 BCM 첨단 기술 코어 의 M.E. 디킨슨과 T.J. Vadakkan에 NIH(AI036211, CA125123 및 DK056338)의 자금 지원을 제공합니다.
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모든 마우스는 병원체가 없는 조건에서 유지되었고, 모든 절차는 베일러 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 준비
<ol><li>크로스 Mx1-Cre17 및 Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (톰)18 마우스 (잭슨 연구소에서 구입) αSMA-GFP 마우스 (박사에 의해 여기에 제공) 이보 칼라지치와 헨리 크로넨버그)는 Mx1-Cre+Rosa26-tomato+α SMA-GFP+(Mx1/토마토/αSMA-GFP) 기자 마우스(그림 2A)를 생성한다.</li>
	<li>Mx1-Cre 유도의 경우, 10 일 동안 격일로 25 mg / kg pIpC로 마우스를 주입하십시오.</li>
	<li>야생형 C57BL/6 마우스(WT-BMT)19에서 1 x 106개의 전체 골수 단핵 세포의 정맥 이식 전 9.5 Gy 1일 마우스를 조사한다.</li>
	<li>6-8주 간의 회복 후, 아래에 설명된 페리오스텔스 세포 이동 프로토콜의 생체 내 이미징에 대상 마우스를 입력하였다. 참고: Mx1-Cre 마우스의 조사 및 WT-BMT는 상해에 반응할 수 있는 내인성 Mx1 표지된 조혈 세포를 제거하기 위하여 필요합니다. 6~8주 후 조사 후, 호스트의 조혈 세포 수는 <5%에 이르므로 이미징19에 대한 준비가 되어 있습니다.</li>
</ol>2. 마우스 구속 및 이미징 마운트
<ol><li>50mL 원문 튜브로 마우스 구속을 만듭니다(그림 1A).<ol>
<li>뾰족한 가위를 사용하여 원물 바닥을 뚫고 구멍을 뚫습니다. 아래 구멍에서 원식 의 상단으로 잘라냅니다 (절단 면은 구속의 상단이 될 것입니다).</li>
		<li>이전 컷과 평행하게 약 4~5cm 길이의 컷을 만들고 구속의 상단에서 중간(~2cm)을 줄입니다. 원식의 이 섹션을 제거하고 가장자리가 필요했던 매끄러운.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조정 가능한 각도 플레이트, 0.5" 광학 포스트 및 0.5" 게시물에 대한 직각 클램프, 0.1875" 헥스(그림 1B 및 재료 표)를 사용하여 원적 튜브 이미징 마운트를 구성합니다.<ol>
<li>각도 플레이트를 35° 각도로 조정합니다. 각도 플레이트의 왼쪽에, 플레이트의 뒷면에서 두 번째 구멍에 광학 포스트를 나사.</li>
		<li>조정 가능한 플레이트의 오른쪽에스프링로드 0.1875" 육석 잠금 0.25" 엄지손가락나사를 플레이트의 앞면과 마지막 구멍에서 두 번째 구멍에 삽입합니다. 직각 클램프는 광학 포스트와 함께 사용되어 원물 마우스 구속을 제자리에 고정시합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 수술 전 수술
<ol><li>마우스 마취<ol>
<li>통증 관리를 위해 수술 전 30-60분 동안 지속적인 방출 부프레노르핀(1 mg/kg BW)으로 마우스를 피하한다.</li>
		<li>설치류 III CCM 조합(콤보 III)을 사용하여 마취생쥐를 마취하여 37.5 mg/mL 케타민, 1.9 mg/mL 자일라진, 및 0.37 mg/mL 아세프로마진을 함유하고 있다. 마우스에 대 한 적절 한 복용량은 0.75-1.50 체중의 1 kg 당 mL. 복용량 지속 됩니다 30-45 분.</li>
		<li>마우스가 마취되면 안과 연고를 멸균 면봉으로 눈에 바르면 눈탈수림을 방지하십시오.</li>
		<li>장기 이미징(>45분)의 경우 마취를 다시 투여하여 다음과 같이 적절한 마취 깊이를 유지하십시오.<ol>
<li>계획된 이미징 지속 시간(추가 체디션 의 30분 당 0.75 mL/kg BW)에 대한 마취를 유지하기에 충분한 양의 콤보 III로 1mL 주사기를 준비한다. 25 G 나비 바늘 주입 세트를 12인치 튜브로 주사기에 부착하고 튜브와 바늘을 통해 마취제를 밀어 넣습니다.</li>
			<li>나비 바늘을 인과간으로 삽입한 다음 바늘을 제자리에 테이프로 놓습니다. 참고: 이것은 추가 콤보 III가 동물을 움직이거나 보기의 평면을 방해할 필요가 없다는 것을 화상 진찰 도중 관리되는 방법입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>시술 내내 37°C에 보관된 가열 패드로 열 지원을 제공합니다. 장기간 이미징(>1hr)의 경우 추가적인 유체 지원이 필요합니다.  보조 유체는 이미징 중 추가 콤보 III 또는 33 mL/kg 식염수(0.9 NaCl) 피하시 I.P.를 제공할 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 구속 및 수술 부위의 준비<ol>
<li>클리퍼를 사용하여 머리 꼭대기에서 가능한 한 많은 머리카락을 제거합니다. 면도 부위에 탈모 크림을 바르면 수술 부위에 남은 모발을 제거하십시오.</li>
		<li>발가락 핀치에 대한 응답이 부족하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다. 15 분 후, 마우스가 완전히 마취되지 않은 경우, 콤보 III (<0.75 mL / kg BW)의 두 번째 작은 복용량을 투여한다.</li>
		<li>마우스를 구속 꼬리에 먼저 놓고, 코가 원물 의 가장자리에 약간 걸려 있도록 충분히 뒤로 슬라이딩합니다.</li>
		<li>의료 용 테이프를 사용하여 원적 튜브의 바닥에 앞발을 테이프로 테이프.</li>
		<li>35° 각도로 설정된 이미징 마운트에 마우스로 원식 튜브를 배치하고 직각 클램프(그림 1C)를 사용하여 고정합니다.</li>
		<li>마우스가 이미징 마운트에서 안전해지면 베타딘 스크럽과 70%의 이소프로필 알코올을 번갈아 가며 수술 부위를 3배 청소하십시오. 다시 말하지만, 동물이 완전히 진정되어 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>마우스를 깨끗한 흡수 패드로 옮기고 커다란 멸균 장을 만들기 위해 마우스 위에 커튼을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 외과 적 절차
<ol><li>개구부 절개<ol>
<li>미세 한 팁 포셉을 사용하여, 피부를 즉시 오른쪽 귀에 내간을 선택합니다. 미세 절 가위를 사용하면 집게가 들고있는 피부를 잘라냅니다. 참고: 위에서 설명한 방법을 사용하여 절개를 시공하면 절차 후 봉합에 더 적합한 둥근 절개가 생성됩니다.</li>
		<li>왼쪽 귀(<1cm)를 향한 초기 절개에서 시작하여 횡방향 절개를 합니다.  초기 절개에서 시작하여 동물의 코로 다시 절개를 하십시오 (오른쪽 눈을 지나 ~ 2-3 mm).</li>
		<li>포셉과 가위를 사용하여 피부와 분리하여 피부와 갈바리아 골막수로부터 피부를 분리하는 결합 조직을 부드럽게 잘라냅니다.</li>
		<li>멸균 면봉을 사용하여 피부 플랩 상단에 안과 연고를 바르습니다.  부드럽게 피부 플랩을 집어 왼쪽 눈 위에 접습니다. 궁수와 관상 봉합사의 교차점이 명확하게 노출되어야 합니다(그림 1E). 참고: 안과 연고는 피부 플랩을 제자리에 유지하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>모든 혈액과 잔류 모발의 영역을 청소하기 위해 멸균 PBS로 열린 표면을 플러시하십시오. 참고 : 필요한 경우 미세 한 양면을 사용하여 홍조 후 남아있는 머리카락을 제거하지만 음막 이 손상되지 않도록주의하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미세 골절<ol>
<li>calvaria에 미세 골절을 생성하려면 29 G 인슐린 주사기의 플런저를 제거하고 주사기의 백 엔드를 300-400 uL 마크 주위로 자른다. 참고: 이 단계를 사용하면 부상을 생성할 때 해부 범위 하에서 기동하기가 더 쉬워집니다.</li>
		<li>관상 봉합사로부터 코쪽으로 베벨(1~2개의 바늘 폭)의 끝을 놓고, 1~2개의 바늘 폭을 궁합봉의 오른쪽에 놓는다(도 1E).</li>
		<li>주사기를 시계 방향으로 부드럽게 회전한 다음 시계 반대 방향으로 여러 번 회전합니다. 참고: 젊은 쥐에서는 원형 미세 골절을 만들기 위해 매우 적은 양의 하방 압력이 필요합니다. 이 출혈을 일으키는 원인이 되고 화상 진찰을 방해할 것이기 때문에, 바늘이 두뇌를 관통하지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>27 G 바늘을 사용하여 미세 골절을 ~0.4 mm로 넓습니다. 뼈 조각이 미세 골절에 남아 있으면 PBS로 영역을 플러시하십시오. 뼈 조각이 여전히 미세 골절에 남아 있는 경우 29 G 바늘을 사용하여 부드럽게 스쿱하십시오.</li>
		<li>4.2.1-4.2.4단계를 반복하여 좌측에 부상을 입습니다. 참고: 이 시점에서, 두 가지 옵션이 있습니다: 1) 즉시 CCL5 치료로 진행 (섹션 4.3) 및 이미징 (섹션 5); 또는 2) 6절 수술 후 수술 후 수술 부위를 닫습니다. 24 시간 후에 마우스를 다시 마취하고 수술 시력을 다시 열고 CCL5 (섹션 4.3)로 부상을 치료하고 인포탈 이미징 (섹션 5) 및 수술 후 치료 (섹션 6)를 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CCL5 치료<ol>
<li>RANTES (100 ng /mL)의 주식에서 지하 멤브레인 매트릭스 (재료의 표)를 사용하여 10 ng / mL의 용액을 만듭니다. 이 용액을 얼음위에 두어 매트릭스를 액체 형태로 유지합니다.</li>
		<li>2-20 μL 파이펫을 사용하여 CCL5(10 ng/μL)의 2μL(10 ng/μL)으로 각 부상을 치료합니다(이 파이펫 팁은 점성 액체를 사용할 때 더 효과적입니다). 행렬을 굳게 할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>매트릭스가 고화되면, 부드럽게 조직이 탈수되지 않도록 피부 플랩으로 calvaria를 커버. 이미징 전에 1시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 인트라바이탈 이미징
<ol><li>현미경 설정<ol>
<li>멀티 광자 레이저 (펨토초 티타늄 사파이어 레이저)를 켭니다. 파장을 880nm로 설정하고 뼈의 제2 고조파 생성(SHG) 이미징(440nm)의 힘을 조절한다.</li>
		<li>GFP-및 tdTomato 표현 세포의 흥분을 위해 488 nm 및 561 nm 고체 상태 레이저를 각각 켭니다.</li>
		<li>두 번째 고조파 생성(405-455 nm 검출) 및 GFP(505-550 nm 검출) 신호를 위해 PMT(광증튜브) 검출기를 켭니다. 토마토 (590-620 nm 검출) 신호에 대한 HyD 3 검출기를 켭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>장착<ol>
<li>마우스를 스코프로 이동하기 전에 마우스 머리 뒤쪽을 부드럽게 눌러 칼바리아의 시각적 평면을 확인합니다. 평면이 평평하지 않은 경우 마우스 구속을 왼쪽 또는 오른쪽으로 부드럽게 회전하여 위치를 조정합니다. 참고: 충분한 이미지 품질을 보장하기 위한 중요한 단계입니다.</li>
		<li>멸균 2% 메틸셀룰로오스를 물(w/v)에 바르면 칼바리아와 피부 플랩 전체를 덮고 조직의 건조를 방지합니다.</li>
		<li>XYZ 축 전동 현미경 단계(그림 1G)에 마우스를 놓습니다. 상피광을 이용하여, 마우스를 정렬하여 1) 현미경에 직면하고 2) 관상 및 처탈 봉합사의 교차점이 단계의 중심 기준점이다.</li>
		<li>이미징 영역에 유리 커버를 놓고 정렬을 다시 확인합니다(그림 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>시간 경과 이미징<ol>
<li>낮은 배율 렌즈(NA = 0.95로 25배 물 침수 목표)를 사용하여 calvaria를 스캔합니다. 궁수 및 관상 봉합사 교차의 참조 이미지를 획득합니다.</li>
		<li>세포에서 SHG 및 형광 신호를 사용하여 각 부상 시력을 찾아 XYZ 좌표뿐만 아니라 처상 및 관상 봉합사로부터의 거리(도 2B)를 기록합니다.</li>
		<li>장기간 이미징을 위해 관상 또는 좌활봉에 위치를 선택합니다. 이미징 중에 참조에서 이 영역의 자세한 Z 스택 이미지를 촬영합니다. 참고: 봉합사는 알려진 P-SSC 틈새 시장을 나타내기 때문에 칼바리아 손상에 대한 응답으로 세포가 마이그레이션되는 곳입니다.</li>
		<li>시간 경과 소프트웨어 설정을 사용하여 최소 1시간 동안 1분마다 이미지를 기록합니다. 스냅숏 사이의 시간에 현재 시야 필드를 초기 시야 필드와 비교합니다. 서로 다른 경우 Z 스택 이미지를 사용하여 뷰 필드를 조정해야 하는 방향을 결정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 수술 후 동물 관리
<ol><li>이미징 후, 노출된 칼바리아를 멸균 PBS로 헹구어 메틸셀룰로오스를 제거합니다.</li>
	<li>절개를 닫기 위해 피부 플랩을 칼바리아 위에 부드럽게 놓습니다. 멸균 면봉을 사용하여 잔류 안연고를 제거하고 절개 부위를 건조시다.</li>
	<li>모노필라멘트 나일론 5-0 사이즈 비흡수성 봉합사를 C-1 역절단 바늘로 사용하여 수술 부위를 닫습니다. 멸균 면봉을 사용하여 밀폐 절개에 트리플 항생제 연고를 적용하십시오. 참고 : 흉터는 고품질의 봉합 기술과 최소 출혈로 감소됩니다.</li>
	<li>따뜻한 표면에 깨끗한 케이지에 마우스를 놓고 흉골 재정이 달성 될 때까지 매 15 분마다 확인하십시오.</li>
	<li>지속적인 방출 buprenorphine의 두 번째 복용량을 관리 72 수술 후 h.</li>
	<li>봉합사(~1주)가 제거될 때까지 매일 허들 동작, 주름이 있는 모피 및/또는 어약이 부족한 경우 모니터링합니다.</li>
</ol>

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L.C.O. 및 D.P.는 "뼈 수리에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포"라는 제목의 출원 중인 특허를 공개합니다(BAYM. P0264US. P1). 나머지 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

뼈 치유 하는 동안, periosteal 세포는 새로 분화 된 연골 세포와 부상 callus3 내에서 골세포의 주요 소스입니다. 골수와 유사하게, 골성/연골성 SSC도 골수4,5,6에서 확인되었다. 내인성 P-SSC 기능적 특성을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 일입니다. 종종 SSC의 철새 역학은 시험관 내에서 평가되므로 생체 시스템?...

골절 수리는 배아 골격 발달 및 리모델링과 구별되는 동적 다세포 과정입니다. 이 과정에서 손상된 조직으로부터의 부상 신호 유도는 골격 줄기/전구 세포의 신속한 모집, 증식 및 후속 분화로 이어지며, 이는 골절의 전반적인 안정성 과 고정에 모두 중요합니다1. 특히, 골절 치유의 초기 단계는 주로 periosteal 상주 세포2에 기인하는 부드러운 callus 형성을 필요로한다2. 뼈가 다치면, periosteal 세포의 부분 집합은 급속하게 반응하고 periosteum 내의 명백한 골격 줄기/선조 세포 집단의 존재를 연루하는 callus3 내의 새로 분화한 연골 중간체 및 골에 기여합니다. 따라서, periosteum-거주자 골격 줄기 세포(SSC)의 식별 및 기능적 특성화는 퇴행성 뼈 질환 및 뼈 결함에 대한 유망한 치료 접근법을 구성한다4.
SSC는 골수를 포함하여 다중 조직 위치에 상주하는 것으로 생각됩니다. 골수와 유사하게, 골성/연골성 SSC도 골수4,5,6에서 확인되었다.  이러한 periosteal SSC (P-SSC)는 태아 뼈 발달 동안 초기 중간 엽 계보 마커 (즉, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 및 Axin2-CreER8)로 표시 될 수 있습니다4,7,8,9,10. 이러한 단일 유전 계보 추적 모델의 중요한 한계는 표지된 세포 집단 내의 상당한 이질성이 있다는 것입니다. 또한 라벨이 부착된 SSC를 생체 내에서자손과 구별할 수 없습니다. 이러한 제한을 해결하기 위해 최근 이중 리포터 마우스(Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+)를 개발하여 골수 SSC(BM-SSC)11에서 P-SSC를 뚜렷하게 시각화했습니다. 이 모델을 사용하면 P-SSC가 Mx1+αSMA+ 듀얼 라벨링으로 표시되는 반면, 보다 분화된 Mx1+ 세포는 골수, 내피 스텔스 및 페리오스핑 표면, 피질 및 궤적 골격11,12에 상주하는 반면, 더 분화된 Mx1+ 세포로 표시됩니다.
여러 사이토카인과 성장 인자는 뼈 리모델링 및 수리를 조절하는 것으로 알려져 있으며 중요한 세그먼트 결함1,13에서 골격 수리의 향상을 위해 테스트되었습니다. 그러나, 뼈 구획의 물리적 장벽의 중단을 통해 생성 된 부상 모델의 세포 복잡성으로 인해, 내인성 P-SSC 마이그레이션 및 치유 중 활성화에 이러한 분자의 직접적인 영향은 불분명하다. SSC의 기능적 특성 및 철새 역학은 종종 다른 세포 집단에서 이주를 유도하는 것으로 알려진 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 트랜스웰 또는 스크래치 분석을 수행함으로써 시험관 내에서 평가됩니다. 따라서, 생체 내 시스템에서 해당 되는 생체 내 시스템에서 적용을 위한 이러한 체외 실험의 결과 해석은 도전적이다. 현재, 골격 줄기/전구 세포 이동의 생체 내 평가는 전형적으로 실시간으로 관찰되지 않는다; 오히려, 그것은 골절 후 고정 된 시점에서 측정5,7,14,15,16.
이 방법의 제한은 마이그레이션이 단일 셀 수준에서 평가되지 않는다는 것입니다. 오히려 세포 집단의 변화를 통해 측정됩니다. 살아있는 동물 내 현미경 검사법과 추가 리포터 마우스의 생성에 있는 최근 발전 때문에, 개별 적인 세포의 생체 내 추적은 지금 가능합니다. 살아있는 동물 내 생명 현미경 을 사용하여, 우리는 Mx1/토마토/αSMA-GFP 마우스에 있는 24-48 시간 상해 내의 뼈 상해에 calvaria 봉합 틈새 틈새에서 P-SSCs의 명백한 이동을 관찰했습니다.
CCL5/CCR5는 최근 조기 부상 대응 중 채용 및 활성화 P-SSC에 영향을 미치는 규제 메커니즘으로 확인되었습니다. 흥미롭게도, 실시간으로 부상에 대한 응답으로 상당한 P-SSC 마이그레이션의 검출이 없었다. 그러나 CCL5로 부상을 치료하면 실시간으로 캡처할 수 있는 P-SSC의 강력하고 방향별 별다른 마이그레이션이 생성됩니다. 따라서, 이 프로토콜의 목적은 CCL5로 처리한 후에 실시간으로 P-SSC의 생체 내 이동을 기록하는 상세한 방법론을 제공하는 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="719">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">&#189;&#8221; optical post</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:135px;">TR2</td>
			<td style="width:247px;">For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">27G needle</td>
			<td style="width:175px;">BD PercisionGlide</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">29G insulin syringe</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>102-SN05C905P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">50 mL conicol tube</td>
			<td style="width:175px;">Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>For mouse restraint</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Adjustable angle plate</td>
			<td style="width:175px;">Renishaw</td>
			<td>R-PCA-5023-50-20</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:175px;">Coviden</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">betadine surgical scrub</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Buprenorphine SR-LAB</td>
			<td style="width:175px;">ZooPharm</td>
			<td></td>
			<td>1mg/mL Sustained Release</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Combo III</td>
			<td style="width:175px;">Obtained from staff veterinarian</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:247px;">37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Coverslip</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td>24 x 40 premium superslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Fine tip forcepts</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Ketamine</td>
			<td style="width:175px;">KetaVed</td>
			<td>50989-161-06</td>
			<td style="width:247px;">100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td>
			<td style="width:175px;">Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Matrigel</td>
			<td style="width:175px;">R &#38; D Systems</td>
			<td>344500101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:164px;">Medical tape</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>100199</td>
			<td>3&#34; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Methocellulose</td>
			<td style="width:175px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Microdissection scissors</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>1456-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:175px;">Anaheim automation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Needle holder</td>
			<td style="width:175px;">FST</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Nonabsorbable sutures</td>
			<td style="width:175px;">McKesson</td>
			<td>S913BX</td>
			<td style="width:247px;">monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Rugby</td>
			<td>0536-1086-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">RANTES</td>
			<td style="width:175px;">Biolegend</td>
			<td>594202</td>
			<td>10 &#181;g/50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Right-angle clamp for &#189;&#8221; post, 3/16&#8221; Hex</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Spring-loaded 3/16&#8221; Hex-locking &#188;&#8221; thumbscrew</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td>TS25H</td>
			<td>For imaging mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile cotton swabs</td>
			<td style="width:175px;">Henry Schen</td>
			<td>100-9249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Sterile DPBS (1x)</td>
			<td style="width:175px;">Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:164px;">Sterile drapes</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>25-517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Surgical gloves</td>
			<td style="width:175px;">McKessen</td>
			<td>3158VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Triple antibiotic ointment</td>
			<td style="width:175px;">Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td>
			<td>51672-2120-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">REF 367298</td>
			<td style="width:247px;">25G butterfly needle infusion set with 12&#34; tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

Periosteal 골격 줄기 세포 (P-SSC)는 평생 뼈 유지 보수 및 수리에 필수적이며 골절 치유를 향상시키기 위한 치료법 개발에 이상적인 초점입니다.  Periosteal 세포는 골절 치유를 위한 새로운 연골 세포 및 골세포를 공급하기 위하여 상해로 급속하게 이동합니다. 전통적으로, 세포 이동을 유도 하는 사이토카인의 효능은 트랜스웰 또는 스크래치 분석 능력을 수행 하 여 체외에서 만 실시 되었습니다. 다광원 여기를 이용한 인트라바이탈 현미경법의 발전과 함께, 최근 1) P-SSC가 CCL5로 알려진 CCR5 리간드를 이용한 철새 유전자 CCR5 및 2) 치료를 발현하는 것으로 밝혀졌으며, CCL5에 대응하여 골절 치유및 P-SSC의 이동을 향상시킨다. 이러한 결과는 실시간으로 캡처되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 CCL5로 치료 후 부상으로 칼변이 봉합사 골격 줄기 세포(SSC) 틈새 에서 P-SSC 마이그레이션을 시각화하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 마우스 구속 및 이미징 마운트의 구성, 마우스 칼바리아의 수술 준비, 칼바리아 결함 유도 및 시간 경과 이미징의 수집에 대해 자세히 설명합니다.

골격 선조는 철새 또는 순환 잠재력을 가지고 제안되었습니다20. 최근, Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+(Mx1/토마토/αSMA-GFP) 기자 마우스가 생성되었으며, P-SSC는 Mx1+α SMA+ 듀얼 라벨링(그림 2A,B)으로 표시되어 있습니다. Mx1+α SMA+ P-SSC의...

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Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K 조회수.  Baylor College of Medicine. 이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.

비디오: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

면역 결핍 마우스에서 인간 골격 근 이종이식 수행

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...