La levure est l’organisme modèle populaire, non seulement pour les études génétiques, mais aussi pour les études biochimiques des protéines et autres macromolécules extraites de types sauvages et de souches de levure mutante. Cependant, en raison de leurs parois cellulaires dures, un défi majeur auquel les chercheurs sont confrontés est cette lyse efficace des cellules de levure sans endommager la teneur cellulaire. L’isolement des macromolécules biologiques intactes est généralement critique, dépendant de la température.
La préparation des extraits à basse température permet de s’assurer que les protéases et nucléases intracellulaires restent inactives, ce qui entraîne un isolement fiable des protéines intactes, des acides nucléiques et d’autres macromolécules pour une lyse suffisante. Diverses méthodes sont disponibles pour obtenir des extraits de levure par la lyse enzymatique, chimique et physique. Cependant la lyse enzymatique est chère en raison de l’exigence des enzymes purifiées pour digérer la paroi cellulaire, limitant ainsi l’utilisation d’un plus petit nombre de cellules.
En outre, les réactions enzymatiques doivent être surveillées de près pour empêcher la digestion et la lyse prématurée des cellules. Les méthodes chimiques utilisant de forts agents dénaturants, bien qu’efficaces, entraînent la dénaturation des protéines et, en tant que telles, ne conviennent pas à l’isolement des complexes protéiques ou des enzymes fonctionnelles. Les méthodes physiques, telles que la lyse sous haute pression dans une presse Français peuvent être effectuées dans le froid à quatre Degrés Celsius, mais ce n’est pas assez froid pour prévenir la dégradation et la dénaturation de toutes les protéines indigènes.
D’autres méthodes physiques populaires sont l’utilisation d’un mortier et d’un pilon, d’un mélangeur ou d’un moulin à café pour moudre les cellules de levure réutilisées dans un tampon de lyse et congelées sous forme de gouttelettes ou de broyage et de mélange de perles de verre et de levure dans un moulin à batteur de perles de préparation rapide ou une lyse par sonication. Cependant, le broyage manuel est laborieux et le rendement protéique qui en résulte peut varier considérablement selon les techniques employées tandis que la lyse par sonication ou broyage dans un mélangeur, un moulin à café ou un moulin à batteur de perles génère une quantité substantielle de chaleur, ce qui entraîne une dénaturation et une dégradation des protéines. Par conséquent, pour obtenir une lyse cellulaire de levure avec des protéines dans leur état natal avec une dénaturation et une dégradation minimales pour des applications telles que la purification de complexes protéiques fonctionnels, des analyses biochimiques ou la détection de modifications post-translationnelles fugaces, il est essentiel d’utiliser une méthode de lyse facilement évolutive qui minimisera la production de chaleur tout en permettant une lyse efficace quelle que soit la quantité de cellules.
Ici, nous décrivons une méthode qui implique l’utilisation d’un moulin cryo congélateur pour la lyse des cellules dans l’azote liquide à moins 196 Celsius pour générer des extraits de cellules congelées permettant ainsi la récupération de macromolécules fonctionnelles intactes, telles que les protéines ou l’ADN et l’ARN, à des températures très basses qui minimise la dénaturation et la dégradation. Cette méthode peut être facilement adaptée pour une utilisation avec n’importe quel type d’échantillon de cellules ou de tissus de n’importe quelle espèce, y compris des échantillons médico-légaux et même anciens récupérés dans des sites archéologiques ou trouvés congelés dans le pergélisol. L’usine de congélation utilise une chambre de broyage électromagnétique supraconductrice qui déplace rapidement une barre métallique solide d’avant en arrière dans un fichier en polycarbonate contenant l’échantillon à pulvériser entre les bouchons d’extrémité en acier inoxydable.
Cette méthode de lyse cellulaire physique permet une lyse plus efficace et se traduit reproductiblement par un extrait de meilleure qualité. Les cellules de levure ont été cultivées à une concentration de 10 millions de cellules par mil. Ces cellules de levure ont été placées avant la bouteille réfrigérée de centrifugeuse et ont été filées pendant 10 minutes à 2,400 G.Une fois la rotation est complète, décantant le supernatant sans déranger les cellules granulées.
Cette pastille a été résuspendée dans une petite quantité d’eau glacée froide, soit environ la moitié du volume initial de la culture pour laver les cellules. Les cellules résuspendées ont de nouveau été filées pendant encore 10 minutes à 2400 G.Une fois le tour suivant terminé, nous, encore une fois, décantons tout le supernatant sans déranger la pastille. Cette pastille sera ensuite réutilisée et 15 ML de tampon de lyse glacée.
Assurez-vous que la pastille est complètement résuspendée. Les cellules résuspendées doivent rester sur la glace dans un tube prédémenté jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’étape suivante. Portez toujours de l’équipement de protection individuelle lorsque vous manipulez de l’azote liquide, comme des lunettes de sécurité, une protection des mains et des manteaux de laboratoire.
Pour maximiser notre dextérité, nous portons souvent une paire de gants thermiques blancs pris en sandwich entre deux paires de gants de nitrile. Changez fréquemment les gants extérieurs et nitrile, car ils se déchirent facilement après avoir été exposés à de l’azote liquide. Dans notre laboratoire, nous transférons un aliquot d’azote liquide dans un petit récipient d’azote liquide de cinq litres.
L’azote liquide est ensuite versé dans un tube de 50 ML qui a été pré-refroidi sur de la glace sèche. Une fois que le tube de 50 ML est plein d’azote liquide, nous ajoutons l’extrait de levure lentement, d’une manière goutte sage au tube par incréments de 1,5 millilitre. Pour minimiser la formation de grosses pastilles de maïs soufflé, la suspension de levure est ajoutée dans un mouvement circulaire.
Pour empêcher davantage la formation de grosses pastilles de maïs soufflé, nous utilisons de gros forceps pour nous assurer que toutes les granulés ont entre 0,3 et 0,5 centimètre de diamètre. Puisque l’azote liquide s’évapore toujours, assurez-vous de remplir le tube avec de l’azote liquide avant d’ajouter chaque aliquot de 1,5 mil de suspension de levure. Une fois que toute la suspension de levure a été transformée en maïs soufflé permettre au tube avec du maïs soufflé de s’asseoir sans couvercle pendant deux à trois minutes pour laisser tout l’azote liquide résiduel s’évaporer.
Pour être sûr que tout l’azote liquide s’est évaporé, fermez le couvercle presque complètement et secouez doucement. S’il y a un bruit de sing, il indique que l’azote liquide ne s’est pas encore complètement évaporé. Ouvrez le couvercle pendant une minute environ pour permettre au reste de l’azote liquide de s’évaporer avant de fermer le couvercle hermétiquement.
Le liquide résiduel dans le tube peut provoquer une explosion si le couvercle est fermé prématurément. Ce maïs soufflé levure peut être stocké presque indéfiniment en moins 80 degrés C.Pour au moins cinq échantillons, assurez-vous que vous avez 30 à 35 litres d’azote liquide disponibles. Remplissez l’usine de congélation jusqu’à la pleine ligne et fermez le couvercle pour permettre au moulin à congélateur de se refroidir pendant quelques minutes.
Encore une fois, n’oubliez pas de porter de l’équipement de protection individuelle lorsqu’il s’agit d’azote liquide. Les flacons de broyage en polycarbonate, les bouchons d’extrémité en acier inoxydable et la barre d’impacteur doivent être pré-réfrigérés avec de l’azote liquide. Gardez ces composants immergés jusqu’à ce que l’azote liquide cesse de bouillonner.
N’oubliez pas de conserver tous les échantillons de maïs soufflé sur la glace sèche jusqu’à ce que tout le processus de broyage soit terminé. Retirez tout l’azote liquide des flacons de broyage et transférez votre maïs soufflé dans le flacon. N’oubliez pas de placer une barre d’impacteur magnétique dans le flacon de broyage ainsi.
Sceller le flacon de broyage en plaçant soigneusement le bouchon en acier inoxydable uniformément à l’extrémité du flacon de broyage. Nous frappons chaque extrémité du flacon de broyage sur un panneau de pain en bois avec une vibration absorbant le support en caoutchouc pour s’assurer que les bouchons d’extrémité sont placés correctement et scellent les flacons de broyage étroitement. Il est important de fixer les bouchons d’extrémité pour s’assurer qu’ils ne se détachent pas et permettent aux échantillons de se déverser dans l’usine de congélation pendant le processus de broyage.
Placer un flacon de broyage dans la chambre de broyage du moulin à congélateur et verrouiller en place. Fermer le couvercle du congélateur et moudre l’échantillon pendant trois cycles à deux minutes par cycle, à un taux de concassage de 14. Une fois les cycles de broyage terminés, déverrouillez le flacon avec le lysate de la cellule de poudre congelée.
Pour éviter que le lysate ne dégele, travaillez rapidement et soigneusement pour dévissez l’une des prises d’extrémité à l’aide de l’outil d’ouverture. Une fois le flacon ouvert, retirer la barre d’impacteur et transférer rapidement l’extrait de poudre congelé sur un plat de pesage en plastique pré-réfrigéré. Récupérer autant d’extrait congelé que possible en tapant le flacon sur la planche à pain en bois.
Une fois que toute la poudre est retirée du flacon, transférez rapidement tous les extraits de poudre dans un tube pré-étiqueté de 15 mil maintenu sur de la glace sèche. Bien qu’il soit préférable de procéder à la décongélation et à l’utilisation des extraits immédiatement pour minimiser la dégradation des protéines, le lysate de poudre congelé peut être stocké pendant la nuit à moins 80, si nécessaire. Décongeler lentement la poudre dans une boue de glace qui circule en continu à l’aide d’une barre magnétique dans un seau à glace.
Pour faciliter même le dégel, enlever la glace qui se développe fréquemment à l’extérieur des tubes, environ toutes les cinq minutes environ. Une fois que les extraits commencent à décongeler au cocktail inhibiteur de la protéase 1X et 10 inhibiteurs protéasome micromolaire MG132 pour prévenir la dégradation des protéines. Une fois que les échantillons sont complètement décongelés, ce qui peut prendre plus d’une heure, faites tourner les échantillons à 3 220 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.
Cette vrille enlèvera la plupart des débris cellulaires du lysate. Lorsque la vrille est terminée, transférer le supernatant dans des bouteilles en polycarbonate qui ont été préalablement refroidies sur la glace et jeter la pastille. Centrifugeuse le supernate et les échantillons à 16 000 G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour clarifier l’extrait.
Une fois la rotation terminée, récupérez seulement le supernatant clair soigneusement à partir du milieu de la colonne liquide sans perturber la couche nuageuse contenant la pièce sur le dessus ou les débris granulés au fond du tube de centrifugeuse. Transférer le lysate clair dans un tube frais pré-refroidi de 15 Mil. Le liquide nuageux restant peut être recentrifugé pendant cinq minutes à la même vitesse pour permettre la récupération d’un peu plus de lysate de gros.
Les extraits sont maintenant prêts à être utilisés dans des expériences, telles que la purification des complexes protéiques et l’immunoprécipitation. Nous avons comparé deux méthodes différentes de lyse cellulaire de levure, à savoir le broyage de perles de verre à quatre Degrés Celsius et une méthode automatisée de broyage cryo à moins 196 Degrés Celsius pour évaluer les protéines et extraits de cellules relativement récupérés préparés avec les deux méthodes. De cette étude, nous avons choisi d’utiliser une souche de levure en herbe portant un plasmide haute copie exprimant un tandem HIS-MYC marqué ubiquitine.
Ainsi nous pouvons évaluer l’affinité de la récupération des protéines polyubiquitinées étiquetées des extraits en gros, suivant la purification d’affinité utilisant talon cobalt SES perles d’affinité d’étiquette suivies du ballonnement occidental avec un anticorps mononnal d’étiquette de HIS. Les protéines polyubiquitines qui sont normalement de très courte durée en raison de leur dégradation rapide par les machines protéasome ubiquitine et offrent ainsi un très bon moyen de comparer la qualité des extraits de gros préparés par différentes méthodes. Comme nous le voyons par la moitié droite de la membrane tachée ponceau, nous avons récupéré un rendement total plus élevé en protéines dans les extraits de gros préparés par le protocole de l’usine de congélation cryo tel que jugé par la coloration ponceau plus intensive dans toute la voie d’extraction de gros.
Ceci est particulièrement clair dans les parties inférieures et supérieures de l’usine de congélation extraits entiers voies. En outre, comme le montre la moitié droite de la tache occidentale his tag, nous avons observé une meilleure récupération de la protéine ubiquitinated tag HIS-MYC suivie d’un retrait à l’aide de perles Talon à partir des extraits de gros préparés par broyage cryogénique. Nous concluons que le moulin cryogénique de congélateur est supérieur à d’autres méthodes pour la préparation des extraits de cellules, particulièrement quand les macromolécules fonctionnelles sont exigées pour l’application en aval.
