Il y a plus de 100 modifications distinctes de l’ARN, dont deux tiers sont des méthylations. Ce protocole fournit une méthode pour l’analyse sensible et précise de l’activité d’auteur de méthylation d’ARN. Cette technique facile à utiliser nous permet de quantifier et de visualiser l’ARN méthylé sans l’utilisation d’anticorps, qui sont généralement sujets aux artefacts.
Samantha Shelton, une étudiante diplômée de mon labo, démontrera la procédure. Pour commencer cette procédure, installez l’essai de méthyltransferase d’ARN de 100 microlitres dans un tube de glace de 1,5 millilitre, tel que décrit dans le protocole de texte. Vortex le tube pour bien mélanger, et centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq secondes pour recueillir la solution au fond du tube.
Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, nettoyez la réaction à l’aide de la purification de la colonne, tel que décrit dans le protocole de texte. Pour effectuer le compte de scintillation liquide, configurez le rack de comptage de scintillation avec un flacon par échantillon, un flacon pour une mesure de fond, et un flacon pour le test de balayage.
Remplissez les flacons de cinq millilitres de solution de comptage de scintillation. Ajouter 10 microlitres de chaque échantillon d’ARN radioactif élut dans un flacon. Serrer le couvercle et mélanger délicatement.
Pour préparer les flacons d’essai de balayage, frottez soigneusement les cotons-tiges sur toutes les surfaces et équipements utilisés pendant la procédure. Ajoutez ces écouvillons aux flacons remplis de solution de scintillation et serrez le couvercle. Pour faire fonctionner les échantillons sur le comptoir de scintillation, ouvrez le capot du comptoir, insérez le support dans la machine et fermez le capot.
Sélectionnez Count Single Rack. Choisissez select user program. Sélectionnez ou créez un programme qui mesure le tritium pendant 60 secondes et frappez Count Rack.
Répétez le compte de scintillation trois fois. Après cela, préparez et réexédez un gel de polyacrylamide dénaturant l’urée, tel que décrit dans le protocole de texte. Transférer 20 microlitres de matière radioactive ARN dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant 20 microlitres de tampon de chargement de gel 2X.
Après avoir préparé l’échelle, incuber les échantillons à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes. Lavez les puits du gel une fois de plus immédiatement avant le chargement de l’échantillon par tampon de pipetting des réservoirs de gel vers le bas dans les puits du gel. Ensuite, chargez 20 microlitres de l’échelle préparée, 20 microlitres des échantillons et 20 microlitres de tampon de chargement de gel 1X dans les voies du gel.
Faire fonctionner le gel à 100 volts pendant 60 à 180 minutes, selon le pourcentage de polyacrylamide. Une fois le gel terminé, retirez le gel de la cassette et placez-le dans une boîte contenant 50 millilitres de tampon 1X TBE avec cinq microlitres de tache de gel nucléique ultrasensible. Incuber sur un rocker pendant cinq minutes pour tacher l’ARN.
Après cela, prenez soigneusement le gel hors de la boîte, et placez-le sur le transilluminateur UV du système d’imagerie par gel avec les puits vers le haut et l’échelle sur la gauche. Concentrez la caméra sur le gel, allumez la lumière UV et prenez une image du gel. Ensuite, éteignez l’exposition aux UV et enregistrez l’image sous forme de fichier TIFF.
Remettre le gel dans la boîte, retirer le TBE et fixer le gel avec 50 millilitres de solution de fixation sur un rocker à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, déplacez doucement le gel vers une boîte noire fraîche contenant 25 millilitres de la solution d’amélioration de l’autoradiographie. Incuber sur le rocker à température ambiante pendant 30 minutes.
Soulevez doucement le gel et placez-le face contre terre sur une feuille de pellicule plastique avec les puits en place et l’échelle sur le côté droit. Placez deux feuilles de papier chromatographie sur le dos du gel et retournez toute la pile. Préchauffer le séchoir à gel à 80 degrés Celsius.
Déplacez le couvercle en plastique sur le séchoir à gel. Insérez toute la pile sous le couvercle en plastique et déplacez le couvercle en plastique vers le bas pour créer un joint. Séchez le gel à 80 degrés Celsius pendant une heure.
Ensuite, éteignez la sécheuse à gel et retirez doucement la pile. Retirer l’enveloppement et le deuxième papier chromatographie. Tapez le reste du papier chromatographie avec le gel séché dans une cassette autoradiogramme.
Dans une pièce sombre, ajouter une feuille de film autoradiographie. Rangez la cassette à 80 degrés Celsius négatif et développez le film au moment opportun, selon l’intensité du signal. Une fois que le film est développé, placez-le sur le dessus de la cassette et utilisez un marqueur de laboratoire pour marquer soigneusement les quatre bords du gel, chaque puits, et la position des dyes XC et BB.
Numérisez le film à une résolution de 300 ou 600 pixels par pouce, et enregistrez l’image sous forme de fichier TIFF. Dans cette étude, un essai anticorps-libre est démontré pour analyser l’activité de méthyltransferase d’ARN. Une course typique d’une réaction in vitro de transcription avec le polymésase d’ARN T7 du petit ARN nucléaire de 7SK montre l’ARN relativement court et fortement structuré.
Il existe plusieurs bandes indésirables, à la fois plus courtes et plus longues que 7SK, probablement résultant d’événements d’initiation transcriptionnelle aléatoire ou de terminaison. Pour cette raison, la purification du gel après la réaction de transcription in vitro est importante pour obtenir un échantillon d’ARN propre. À ce stade, l’ARN d’intérêt peut être identifié par son emplacement par rapport à l’échelle et purifié par la purification du gel.
Un essai représentatif de méthyltransferase d’ARN utilisant la limite inférieure des concentrations recommandées d’ARN et de protéine est montré ici. Cet essai permet à la fois des résultats quantitatifs des comptes de scintillation, ainsi que des résultats qualitatifs de l’autoradiogramme. Ici, un méthyltransferase ARN connu sous le méthylate 7SK est montré pour être en mesure de méthyliquer U6. En outre, comme récemment montré pour 7SK, la liaison de l’histone H4 à MePCE inhibe également la méthylation U6.
Ceci peut être observé dans le compte de scintillation et l’autoradiogramme, montrant la robustesse de ce protocole. L’ARN est susceptible d’être dégradation, alors assurez-vous d’utiliser des reagents sans RNase et de nettoyer soigneusement toutes les surfaces et tout l’équipement. L’ARN étiqueté radioactivement obtenu à partir de cet essai de méthyltransferase peut être directement utilisé pour évaluer l’activité de déméthylase de l’ARN ou l’activité liant l’ARN par essai électrophoretic de décalage de mobilité, par exemple.
Cette méthode permet aux chercheurs de tester l’effet de différents facteurs sur l’activité de méthyltransferase arn, y compris les mutations ponctuelles et les traitements inhibiteurs de petites molécules. Cette méthode utilise des matières radioactives, alors assurez-vous de porter l’EPI approprié, et soyez prudent lors de la manipulation et l’élimination des matières radioactives.
