Ce protocole facilite la préparation et l’administration d’un cocktail viral et phage contre les pseudomonas aeruginosa chez les embryons de poisson zèbre. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une évaluation in vivo de l’efficacité du phage dans la lutte contre l’infection bactérienne. Le cocktail phage est efficace dans les modèles de poisson zèbre de type sauvage et de fibrose kystique.
Ouvrir la possibilité d’appliquer la thérapie de phage aux infections bactériennes dans les patients de mucoviscidose. La thérapie par phage peut également être appliquée pour contrer des infections bactériennes spécifiques dans d’autres systèmes modèles. Préparer un stock de phages pour l’expérience.
Ajouter 1,25 fois 10 aux septièmes phages à un OD 600 de 0,05 P.aeruginosa culture à une multiplicité d’infection d’une fois 10 aux trois négatifs et incuber la culture pendant trois à quatre heures avec secouant jusqu’à ce que l’OD 600 tombe à 0,1 à 0,3. À la fin de l’incubation, incuber le lysate avec un microgramme par millilitre de DNAse et RNAse pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Et pelleter les cellules par centrifugation.
À la fin du filtre de centrifugation, le supernatant par un diamètre poreux de 0,8 micromètre et ajouter 58 grammes par litre de chlorure de sodium et 105 grammes par litre de PEG 6000. Incuber la solution à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, précipitez le phage par centrifugation.
À la fin de la centrofugation enlever le supernatant et dissoudre soigneusement la pastille de phage en 15 millilitres de tampon de chlorure de sodium Tris. Pour purifier les phages par gradient de densité de chlorure de césium, stratifiez d’abord deux millilitres de quatre solutions différentes de chlorure de césium dans les tubes d’ultracentrifugeuse polyallomer pour un rotor SW 41 et ajoutez 3,5 millilitres de suspension de phage à chaque tube. Le chlorure de césium est toxique.
Adoptez toujours des procédures de sécurité appropriées lors de la manipulation et de la mise au rebut de ce composé. Lorsque tous les tubes ont été chargés, placez les tubes dans le rotor en prenant soin que les tubes sont équilibrés. Et centrifuger les échantillons pendant deux heures à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius.
À la fin de la centrifugation, utilisez une seringue avec une aiguille de calibre 19 pour aspirer la couche blanche entre le D égale 1,5 et le D équivaut à 1,4 régions de densité. Et transférer les suspensions dans de nouveaux tubes en polyallomer de taille SW 60. Centrifuger les suspensions pendant au moins 16 heures à 150 000 fois g et quatre degrés Celsius.
Et transférer les bandes visibles dans des tubes de dialyse avec une coupure de 6000 Dalton. Puis dialyser les échantillons prélevés deux fois contre 500 millilitres d’eau pendant 20 minutes par dialyse et toute la nuit contre 500 millilitres de tampon de chlorure de sodium Tris. Le lendemain matin, filtrez le stock de phages résultant avec un filtre pore de 0,22 micromètre et stockez le stock à quatre degrés Celsius.
Le jour de la micro-injection diluer deux solutions micromolaires morpholinos stock dans l’eau stérile à une concentration finale de 0,25 picomolaire par embryon pour obtenir une solution d’injection de morpholino de cinq microlitres. Et ajouter 0,5 microlitres de rouge phénol à chaque solution. Ensuite, utilisez une micropipette de 20 microlitres avec une pointe de chargement de gel fin pour charger une aiguille d’injection micro avec tout le volume de solution mixte morpholino et fixer l’aiguille à un micro manipulateur relié à un support sous un microscope stéréo.
Ensuite, avec une ou deux cellules, les embryons de poisson zèbre disposés sur une lame de verre placée dans une boîte petri de 96 millimètres de diamètre pénètrent dans la chorion et le jaune avec la pointe de l’aiguille de micro-injection et injectent deux nanolitres du mélange morphlino dans l’embryon. À 26 heures après la fécondation, chargez une aiguille de micro-injection avec environ cinq microlitres d’inoculum de P.aeruginosa et insérez l’aiguille dorsalement au point de départ du conduit de Cuvier au cours duquel le conduit commence à s’étendre sur le sac jaune. Injectez un à trois nanolitres de l’inoculum PAO1 dans l’embryon en vous assurant que le volume augmente directement dans le conduit et entre dans la circulation.
Après le transfert d’injection, l’embryon dans l’une des deux nouvelles boîtes de Pétri contenant du moyen E3 frais complété par du phénylthiourea pendant une incubation de 30 minutes ou trois heures à 28 degrés Celsius. Ensuite, chargez une aiguille d’injection micro avec environ cinq microlitres du cocktail phage et fixez l’aiguille au micro-injecteur. Injectez ensuite un à trois nanolitres de cocktail de phage dans le conduit de Cuvier de chaque embryon précédemment injecté avec des bactéries et placez les embryons dans l’un des deux nouveaux plats de Petri contenant du milieu E3 frais complété par du phénylthiourea à 28 degrés Celsius.
À quatre heures après l’infection, utilisez une pipette en plastique pour transférer un embryon anesthésié dans un plat de fond en verre. Et remplir le plat avec chaud faible point de fusion solution agarose. Lorsque l’agarose est froide, remplir délicatement le plat d’E3 moyen complété par une solution anesthésique.
Placez le plat sous le microscope stéréo et utilisez une pointe de pipette pour positionner l’embryon dans l’orientation désirée. Placez ensuite le plat sous un microscope stéréo fluorescent avec un filtre fluorescent pour les bactéries positives GFP pendant jusqu’à 18 heures après l’infection et imagez l’embryon pour la progression de l’expression GFP à neuf, 14 et 18 heures après l’infection. Pour déterminer la charge bactérienne à huit heures après l’infection, transférez 15 embryons micro-injectés anesthésiés dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre et remplacez la solution anesthésique par 300 microlitres de 1% Triton X-100 dans PBS.
Passez les aiguilles à travers l’aiguille stérile de calibre 27 d’une seringue à insuline au moins 15 fois pour homogénéiser les embryons. Et préparer des dilutions en série de l’homogénéité en transférant 100 microlitres du mélange résultant en 900 microlitres de PBS stérile par dilution. Pour sélectionner pour la souche P.aeruginosa résistante à l’ampicilline naturelle, plaquez 10 microlitres des dilutions sur l’agar LB complétés par de l’ampicilline et incubez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, comptez le nombre de colonies. Permettre le calcul du nombre total d’unités de formation de colonies et le nombre moyen d’unités de formation de colonies par embryon infecté. Pour évaluer la létalité de l’infection à P.aeruginosa, marquer les embryons injectés à 20 heures après l’infection au microscope stéréo en comptant le nombre d’embryons blancs opaques morts.
Calculez ensuite la demi-concentration létale maximale de 50 doses de P.aeruginosa qui a entraîné la mort de 50% des embryons injectés à 20 heures après l’infection. Pour valider le phénotype de la fibrose kystique, la position altérée des organes internes tels que le foie cardiaque et le pancréas peut être évaluée. La charge bactérienne est réduite par la thérapie par phage dans les embryons de fibrose kystique infectés par P.Aeruginosa.
En 48 heures après la fécondation, les embryons de fibrose kystique infectés par la bactérie P.Aeroginosa positive de GFP, une colonie formant 30 unités par dose d’embryon démontre une létalité de 50 % à 20 heures après l’infection. La thérapie par phage est tout aussi efficace 20 heures après l’infection lorsqu’elle est administrée 30 minutes ou sept heures après l’injection bactérienne. Ici, une fibrose kystique et un embryon injecté positif de P.Aeruginosa de GFP à quatre, neuf, 14 et 18 heures après l’infection sont montrés.
En revanche, la fibrose kystique plus P.Aeruginosa plus l’embryon injecté de phage démontre une fluorescence réduite due à l’action de phage contre les bactéries. La réponse inflammatoire générée par l’infection de P.aeruginosa dans les embryons de mucoviscidose est sensiblement augmentée comme indiqué par l’expression des cytokines pro-inflammatoires, de l’alpha de TNF et de la bêta d’interleukin 1 suivant l’injection de P.aeruginosa comparée au poisson zèbre injecté de contrôle. L’expression des deux cytokines inflammatoires est réduite dans les animaux co-injectés de cocktail de phage cependant.
Les phages doivent être soigneusement purifiés pour éliminer toute endotoxine contaminante qui peut être conservée pendant la préparation. Les préparations des phages peuvent être analysées par microscopie électronique pour évaluer la morphologie virion. Il serait intéressant de vérifier si l’infection chez les patients humains par des bactéries autres que pseudomonas aeruginosa peut être guérie avec la thérapie de phage dans le modèle de poisson zèbre de fibrose kystique.
