Nous tenons à remercier l’Instituto Gulbenkian de Ciência (IGC) de nous avoir donné accès à une partie de l’équipement expérimental décrit dans ce protocole. Ce travail a été soutenu par la Fondation portugaise pour la science et la technologie (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 et La Caixa HR17-00595 à PMD et par une bourse future du Conseil australien de la recherche (FT170100259) à CKM.

1. Préparation des régimes de levure de saccharose (SY)
<ol><li>Peser tous les ingrédients secs (gélose, levure, saccharose) pour l’équilibrage des macronutriments et les régimes d’élevage L3. Les quantités en grammes pour chacun des ingrédients nécessaires à la préparation de 1 L d’aliment sont indiquées à la figure 1B. REMARQUE : Tiendront compte du fait qu’environ 13 mL de nourriture sont nécessaires pour remplir une boîte de Pétri de 60 mm.</li>
	<li>Dissoudre tous les ingrédients dans de l’eau distillée stérile (utiliser environ 50% du volume total d’eau nécessaire pour préparer l’aliment) et remuer le milieu pendant 5-10 min.</li>
	<li>Autoclave pendant 50 min.</li>
	<li>Après avoir permis aux milieux de refroidir, ajoutez des solutions de nipagine et d’acide propionique à l’alimentation, à une concentration finale (v/v) de 3 % et 0,3 %, respectivement. Aux régimes d’équilibrage des macronutriments, ajouter le colorant alimentaire bleu à une concentration finale (v/v) de 1 %. Complétez les volumes totaux avec de l’eau distillée.</li>
	<li>Versez soigneusement les régimes alimentaires dans des boîtes de Pétri de 60 mm, de sorte que la quantité de nourriture versée soit approximativement la même dans chacune des assiettes. Étiquetez les plaques avec les rapports P: C des régimes. REMARQUE : Préparez les régimes d’équilibrage des macronutriments le jour de l’analyse d’alimentation. Si ce n’est pas possible, conservez les régimes préparés à 4 °C, dans un récipient scellé, pendant une durée maximale de 3 jours. Des périodes de stockage plus longues rendent le régime trop sec et trop dur, et les larves ne peuvent pas s’enfouir dans le milieu.</li>
</ol>2. Croisement génétique des lignées parentales
REMARQUE : Utilisez le système Gal4/UAS21 pour configurer les croisements génétiques. Dans ce protocole, afin d’activer la fonction neuronale dans des populations neuronales spécifiques, des vierges femelles de la lignée UAS dTRPA117 ont été utilisées et croisées aux mâles à partir des lignées Janelia Gal4(figure 2A). Le contrôle génétique utilisé était la descendance d’un croisement entre la lignée dTRPA1 et une lignée « GAL4 vide », qui porte Gal4 dans le vecteur utilisé pour générer la collection Rubin Gal4 mais sans fragment régulateur présent (attP2)22. Pour favoriser la suppression neuronale, une ligne UAS codant pour ShibireTS20 peut être utilisée, au lieu de dTRPA1.
<ol><li>Installer des cages de collecte d’embryons de 60 mm avec des plaques de régime d’élevage L3, complétées par de la pâte de levure active.</li>
	<li>Transférer les femelles vierges uas dTRPA1 adultes et les mâles Janelia Gal4, âgés de 5 à 8 jours, dans les cages de collecte d’embryons et permettre à l’accouplement de se produire pendant 24 à 48 h, à 25 °C, avec une humidité de 60 % et un cycle lumière-obscurité de 12 h 12(figure 2A). Pour les cages de collecte d’embryons de 60 mm, utilisez environ 100 femelles vierges et 30 mâles par croisement.</li>
	<li>À la fin de la période d’accouplement, retirez et jetez les plaques de régime d’élevage L3 utilisées dans les croisements génétiques. Remplacez-les par des assiettes fraîches d’élevage L3, afin d’effectuer les pontes et la stadification des larves.</li>
</ol>3. Préparation des larves du troisième stade (L3)
<ol><li>Transférer les mouches adultes accouplées dans des assiettes fraîches d’élevage L3 et laisser la ponte se produire pendant 3 à 4 h, à 25 °C(figure 2B). Assurez-vous que toutes les plaques sont étiquetées avec le génotype, le rapport P: C du régime alimentaire et la date de ponte de l’œuf. REMARQUE: Pour gagner du temps, effectuez la ponte directement dans le régime d’élevage L3, ce qui évite une manipulation supplémentaire des œufs. Dans le cas de criblages génétiques à petite échelle, l’optimisation de la ponte peut être obtenue en utilisant des assiettes de gélose au jus de pomme.</li>
	<li>À la fin de la période de ponte, retirez les plaques des cages et couvrez-les de couvercles en plastique. Dans le cas où l’extrait de levure est utilisé pour compléter les plaques d’élevage L3, assurez-vous d’éliminer toute la levure résiduelle à la fin de la ponte. Ceci est important pour éviter une alimentation non uniforme pendant la croissance larvaire. REMARQUE: Les adultes accouplés peuvent être transférés dans des assiettes fraîches de régime d’élevage L3, de sorte que plus de pontes d’œufs sont effectuées et que des larves plus expérimentales peuvent être obtenues. Des pontes consécutives peuvent être effectuées avec les mêmes adultes pendant toute une semaine de travail.</li>
	<li>Estimer le nombre d’œufs par plaque et maintenir la densité larvaire à un maximum de 200 embryons par plaque. Cette estimation peut être faite en comptant le nombre d’embryons dans un quart de la plaque. REMARQUE : Une plaque surpeuplée retardera le développement larvaire et affectera les comportements alimentaires larvaires.</li>
	<li>Incuber les plaques d’élevage L3 à 18 °C (température permissive), 60 % d’humidité et un cycle lumière-obscurité de 12:12, et permettre aux larves de croître pendant 9 jours(figure 2B).</li>
	<li>Le neuvième jour après la ponte (AEL), prélever trois groupes de 10 L3 dans chacun des génotypes (et pour les répétitions) à tester. De plus, prélever des groupes de 10 L3 pour le contrôle des « aliments sans colorant ». S’assurer que la collecte des larves est effectuée pendant les périodes équivalentes de la journée utilisée pour faire la ponte (p. ex., si la ponte a eu lieu entre 10 h et 14 h, recueillir les larves pendant la même période de temps de 9 jours AEL) et qu’elle est effectuée, aussi doucement que possible, à l’aide d’une pince #5 ou d’une pince de poids plume. Transférer directement les larves comme indiqué à l’étape suivante (3.6). NOTA : Les animaux témoins « aliments sans colorant » sont des larves qui, dans le test d’alimentation, reçoivent de la nourriture sans colorant bleu. Ce contrôle est impératif pour éliminer l’absorbance de fond des extraits larvaires.</li>
	<li>Transférer les larves expérimentales recueillies dans des bateaux de poids de plat en plastique contenant 1 mL d’eau. Assurez-vous que les L3 sont collectés, et non L2, en suivant les instructions données à la figure 3. REMARQUE: La collecte de L3 sur des bateaux en plastique contenant de l’eau ou 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est importante pour garder les larves bien hydratées avant le début de l’analyse d’alimentation. Ceci est particulièrement important si plusieurs groupes L3 expérimentaux de différents génotypes sont collectés en même temps. Gardez une trace de l’ordre de collecte pour chaque groupe, afin de minimiser les différences dans la durée de la privation de nourriture pour chaque groupe. L’utilisation de bateaux en plastique dans cette étape facilite l’étape facultative 4.3 car elle permet aux larves de flotter directement dans le bain-marie.</li>
</ol>4. Activation thermogénétique et test d’alimentation sans choix
REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer les tests d’alimentation à peu près à la même heure de la journée afin de minimiser les variations possibles liées aux rythmes circadiens. Aussi, toujours exécuter les expériences de contrôle (la progéniture de la ligne « Gal4 vide » croisée à UAS dTRPA1 et les larves « aliments sans colorant »), en parallèle avec les génotypes d’intérêt.
<ol><li>Mettre en place un incubateur à 30 °C (température non permissive) et maintenir des niveaux élevés d’humidité (au moins 65%) pour éviter la déshydratation larvaire pendant l’essai.</li>
	<li>Avant de commencer l’essai d’alimentation, équilibrer la température des plaques d’essai en les réchauffant à 30 °C pendant 30 min.</li>
	<li>(Facultatif) Choc thermique des larves expérimentales pendant 2 min dans un bain-marie à 37°C. Effectuez cette étape avec les animaux dans les bateaux de poids en plastique contenant de l’eau. REMARQUE: Le but de cette étape est d’intensifier l’activation neuronale en favorisant la mise à feu des neurones depuis le début du test d’alimentation.</li>
	<li>Gardez plusieurs minuteries réglées pour 1 h prêtes. Le nombre de minuteries à utiliser dépend du nombre de groupes expérimentaux testés et du niveau de compétence de l’expérimentateur dans la manipulation des larves. REMARQUE : L’utilisation de plusieurs minuteries est essentielle pour maintenir la durée de l’essai cohérente pour tous les génotypes.</li>
	<li>Égouttez soigneusement l’eau des bateaux en plastique et, à l’aide d’une brosse douce humidifiée, transférez doucement les groupes L3 des bateaux au centre des plaques d’analyse. Remettez les couvercles des plaques et démarrez une minuterie pour chaque plaque (ou groupe de plaques) afin de maintenir des séances d’alimentation précises de 1 h.</li>
	<li>Laisser les larves se nourrir pendant 1 h, à 30 °C, dans l’obscurité(figure 2C). REMARQUE: La performance de l’essai dans l’obscurité est importante pour contrôler les différences dans les indices visuels entre les régimes, car les régimes diffèrent dans les tons, même s’ils contiennent la même concentration de colorant.</li>
	<li>Arrêtez le test d’alimentation en transférant les plaques dans un bain de glace. Appuyez sur la glace autant que possible pour fournir une surface stable pour les plaques. REMARQUE: Les températures froides favoriseront la fin de l’alimentation en inhibant les comportements d’enfouissement et de creusement. La plupart des larves feront surface dans les assiettes après quelques minutes, facilitant leur récupération dans les étapes suivantes.</li>
</ol>5. Extraction de colorants alimentaires
<ol><li>Préparer des microtubes de 2 mL pour chaque groupe de 10 L3 testés, contenant approximativement les mêmes quantités de billes de verre de 0,5 mm (assez pour remplir la partie inférieure du microtube) et 300 μL de méthanol glacé. Gardez les microtubes dans le froid, à l’aide d’un refroidisseur de banc. ATTENTION : Le méthanol est très inflammable et toxique. Suivez toutes les procédures de sécurité recommandées pour la manipulation de ce réactif, y compris le travail dans un endroit bien ventilé et le port de gants en nitrile. REMARQUE: L’utilisation de méthanol est importante pour fixer les échantillons larvaires et éviter les réactions de mélanisation dans la cuticule.</li>
	<li>À l’aide de pinces #5 ou de poids plume, récupérez soigneusement les groupes de 10 L3 des plaques d’essai d’alimentation et transférez-les sur les couvercles des plaques d’essai contenant de l’eau. Rincez les larves pour enlever les débris alimentaires sur leur corps tout en manipulant doucement les larves pour éviter toute blessure. Tenir un registre du nombre de larves récupérées pour chaque génotype par répétition, afin que la quantité moyenne d’apport alimentaire par larve puisse être quantifiée. REMARQUE: Les larves blessées doivent être jetées car elles auront une cuticule mélanisée, ce qui ne convient pas à la quantification colorimétrique.</li>
	<li>Transférer les groupes L3 sur les microtubes de 2 mL préparés au 5.1.</li>
	<li>Lyser les tissus larvaires pour extraire le colorant alimentaire des intestins par une méthode de lyse mécanique à l’aide d’un lyseur tissulaire et de billes de verre ajoutées à l’étape 5.1. (si un lyzer tissulaire n’est pas disponible, utilisez un pilon homogénéisant). De préférence, effectuez cette étape à 4 °C(Figure 2D). REMARQUE: La durée de cette étape dépendra de l’équipement utilisé. À l’aide d’un lyseur tissulaire conventionnel, une extraction de 1 min suffit. En cas de constrictions temporelles, le protocole peut être suspendu à la fin de cette étape et poursuivi ultérieurement. Conserver les échantillons à -20 °C.</li>
	<li>Transférer les extraits pour nettoyer les microtubes de 1,5 mL, en inversant directement les microtubes de 2 mL sur les nouveaux microtubes de 1,5 mL. Si elles sont effectuées doucement, la plupart des billes de verre resteront au fond du microtube de 2 mL.</li>
	<li>Dégager les débris cellulaires en centrifugant les extraits, à une vitesse maximale de 10 min, à 4 °C.</li>
	<li>Recueillir les surnageants pour nettoyer les microtubes de 1,5 mL. Si des débris cellulaires sont encore visibles dans les surnageants, répétez les étapes 5.6 et 5.7.</li>
</ol>6. Quantification colorimétrique de la consommation alimentaire
<ol><li>Préparer des solutions étalons, pour générer une courbe d’étalonnage, en effectuant des dilutions en série 1:2 dans le méthanol d’une solution de colorant bleu de départ. Comme blanc, utilisez uniquement du méthanol. La concentration des normes dépend des niveaux d’apport alimentaire des animaux. NOTA : Dans le cas de l’écran pilote présenté ici, comme les concentrations de colorant obtenues pour les extraits larvaires variaient de 0,02 à 1,93 μL/mL, on a utilisé une courbe standard obtenue en mesurant les absorbances de 8 dilutions en série d’une solution de colorant bleu de 2 μL/mL dans du méthanol. Si nécessaire, augmenter ou diminuer la concentration de ces solutions, selon la concentration de colorant des échantillons expérimentaux.</li>
	<li>Transférer 100 μL des échantillons expérimentaux (obtenus à l’étape 5.7), étalons et blancs (étape 6.1) dans les puits d’une microplaque de 96 puits et mesurer l’absorbance à 600 nm, à l’aide d’un lecteur de plaque(figure 2E). Pour éliminer l’absorbance de fond, mesurer l’absorbance des extraits obtenus à partir de larves nourries avec des aliments sans colorant bleu comme un « zéro » pour les extraits larvaires (« contrôle alimentaire zéro colorant »).</li>
	<li>Générer une courbe standard et corréler les valeurs d’absorbance obtenues pour les échantillons de chaque groupe larvaire expérimental avec la quantité d’apport alimentaire (volume en mL). Trouver la consommation alimentaire moyenne par larve en tenant compte du nombre de larves recueillies pour chaque groupe à l’étape 5.2</li>
</ol>

<ol>
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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+larval+feeding+circuit+in+Drosophila.">Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).</li><li>Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+measuring+feeding+rate+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).</li><li>Almeida-Carvalho, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ol1mpiad:+concordance+of+behavioural+faculties+of+stage+1+and+stage+3+Drosophila+larvae.">The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+larvae+make+nutritional+choices+that+minimize+developmental+time.">Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time.</a> Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).</li><li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+food+intake+in+Drosophila.">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+foraging+and+social+behavior+by+the+Drosophila+neuropeptide+Y-like+system.">Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system.</a> Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).</li><li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila.">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li><li>Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-regulation+of+cold-resistant+food+acquisition+by+insulin-+and+neuropeptide+Y-like+systems+in+Drosophila+melanogaster.">Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster.</a> Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Avec ce protocole, on pourrait tester la capacité des larves sous activation thermogénétique de populations neuronales spécifiques à réguler les niveaux d’apport en protéines et en glucides, deux macronutriments majeurs, lorsqu’elles sont exposées à des régimes de composition P:C différente. Cette méthode a été testée dans le cadre d’un dépistage préliminaire des larves visant à identifier les populations neuronales associées au contrôle de l’apport alimentaire dans des régimes de qualité ma...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.
Figure 1&#160;was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.

Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Tous les animaux dépendent d’une alimentation équilibrée pour acquérir les quantités nécessaires à la survie, à la croissance et à la reproduction1. Le choix de ce que et combien manger est influencé par une multitude de facteurs d’interaction liés à l’état interne de l’animal, comme le niveau de satiété, et les conditions environnementales, telles que la qualité de la nourriture2,3,4,5. Les protéines et les glucides sont deux macronutriments majeurs et leur apport équilibré est essentiel pour soutenir les processus physiologiques des animaux. Par conséquent, la compréhension des mécanismes neuronaux contrôlant les comportements d’alimentation et soutenant un apport équilibré de ces macronutriments est extrêmement pertinente. C’est parce que les traits du cycle biologique comme la durée de vie, la fécondité et la santé métabolique sont directement affectés par les niveaux d’apport en protéines6,7,8,9,10.
L’utilisation d’organismes plus simples et plus maniables qui présentent des habitudes alimentaires conservées au cours de l’évolution avec des animaux complexes, y compris des mammifères, est essentielle à ce type d’études. Il est important de faire en 1999, ces modèles animaux plus simples offrent une bonne occasion de disséquer des questions biologiques complexes dans un contexte coûteux, éthiquement et techniquement plus efficace. Au cours des dernières décennies, la drosophile,avec sa puissante boîte à outils génétique, son comportement complexe et stéréotypé et son architecture conservée de mécanismes périphériques et de détection des nutriments avec les mammifères, a été un modèle fructueux pour les neurobiologistes comportementaux11. En fin de compte, l’espoir est qu’en comprenant comment l’apport alimentaire est régulé chez cet animal, avec un système nerveux plus simple, nous pouvons alors commencer à démêler les dysfonctionnements neuronaux sous-jacents aux troubles de l’alimentation humaine.
L’étude des substrats neuronaux pour les comportements alimentaires dépend profondément de la capacité de mesurer simultanément l’apport alimentaire des animaux tout en manipulant leur activité neuronale. En raison des quantités minimales d’aliments ingérés, il est extrêmement difficile de quantifier la quantité d’aliments consommés par les mouches, et toutes les méthodes actuellement disponibles présentent des limites importantes. Ainsi, l’étalon-or est d’utiliser une combinaison de méthodologies complémentaires12. Les mouches adultes ont été historiquement favorisées comme modèle génétique et comportemental. Néanmoins, les larves de drosophiles offrent également des possibilités d’étudier les substrats neuronaux codant pour le comportement alimentaire. Le système nerveux central (SNC) larvaire, avec environ 12 000 neurones, est nettement moins complexe que celui de l’adulte, qui contient environ 150 000 neurones. Cette complexité inférieure n’est pas seulement numérique mais aussi fonctionnelle, car les comportements larvaires reposent sur des fonctions de locomotive et des systèmes sensoriels plus simples. Malgré l’apparente simplicité de leur système nerveux, les larves présentent encore des comportements alimentaires complets, et certaines méthodes pour quantifier l’ingestion de nourriture chez les larves de drosophiles ont été décrites5,13,14,15. En s’associant à des manipulations de l’activité neuronale, les larves de drosophiles peuvent constituer un modèle hautement tractable pour comprendre la régulation neuronale de l’apport alimentaire.
Voici un protocole détaillé pour quantifier l’apport alimentaire chez les larves exposées à des régimes alimentaires de différentes qualité de macronutriments. Les régimes, appelés régimes d’équilibrage des macronutriments, différaient par les teneurs en protéines et en glucides, en particulier en ce qui concerne les rapports protéines/glucides (P:C) : 1:1 (régime riche en protéines), 1:4 (régime intermédiaire) et 1:16 (régime pauvre en protéines), comme le montre la figure 1A. Brièvement, une analyse quantitative d’alimentation sans choix a été établie utilisant ces trois régimes basés sur la saccharose-levure isocalorique (SY) teints avec un colorant alimentaire bleu. Étant donné que l’extrait de levure et le saccharose ont été utilisés comme sources de protéines et de glucides, et que les deux contiennent des glucides, la variation des rapports P:C a été obtenue en modifiant l’équilibre de ces deux composants, comme décrit précédemment16 et comme indiqué à la figure 1B. Un aperçu schématique du protocole, montrant les principales étapes expérimentales, est disponible à la figure 2.
Ce protocole a été établi dans le but d’étudier le rôle des populations neuronales spécifiques sur le règlement des niveaux d’alimentation larvaires dans les régimes de différents rapports de P: C et dans le cadre d’un écran neuronal thermogénétique. Un outil neurogénétique bien caractérisé a été utilisé à partir de la famille du potentiel de récepteur transitoire (TRP): canal de potentiel de récepteur transitoire de la drosophile (dTRPA1), qui est un canal cationique à température et tension fermée, permettant la mise à feu des potentiels d’action lorsque les températures ambiantes s’élèvent au-dessus de 25 ° C17. Pour exprimer le transgène dTRPA1, nous avons profité des lignéesGal4 basées sur les régions cis-régulatrices du génome de la drosophile, établies dans le laboratoire Rubin, dans le cadre du projet FlyLight au Janelia Research Campus18,19.
Bien que le protocole, décrit ici, ait été établi dans le cadre d’un écran d’activation, il peut être facilement adapté par l’expérimentateur à d’autres besoins ou intérêts spécifiques, à savoir effectuer un écran de suppression à l’aide du silencieux neuronal sensible à la température ShibireTS20,en alternative au dTRPA1. Cette adaptation et d’autres sont abordées dans les sections protocole et discussion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2112px;" width="2113">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">1.5 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.690.001</td>
			<td style="width:1272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10xPBS</td>
			<td style="width:271px;">Nytech</td>
			<td style="width:247px;">MB18201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.0 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.695.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Greiner Bio-one, Austria</td>
			<td style="width:247px;">628161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">96 well microplates</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-204453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Bench cooler</td>
			<td style="width:271px;">Nalgene, USA</td>
			<td style="width:247px;">Labtop Cooler 5115-0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Blue food dye</td>
			<td style="width:271px;">Rayner, Billingshurst, UK</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Cell disruption media</td>
			<td style="width:271px;">Scientific Industries, Inc.</td>
			<td style="width:247px;">888-850-6208</td>
			<td>(0.5 mm glass beads)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Dish weight boats</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-201606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Embryo collection cage for 60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td style="width:247px;">FLY1212 (59-100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight forceps</td>
			<td style="width:271px;">BioQuip Products, USA</td>
			<td style="width:247px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fly food for stocks maintenance</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Forceps #5</td>
			<td style="width:271px;">Dumont</td>
			<td style="width:247px;">0108-5-PS</td>
			<td>Standard tips, INOX, 11cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">LMS Ltd, UK</td>
			<td style="width:247px;">Series 2, Model 230</td>
			<td>For thermogenetic feeding assay (30&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">Percival Scientific, USA</td>
			<td style="width:247px;">DR36NL</td>
			<td>To stage larvae (19&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Janelia lines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Detailed information in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Macronutrient balancing diets</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Methanol</td>
			<td style="width:271px;">VWR</td>
			<td style="width:247px;">CAS number: 67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:271px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:247px;">H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nitrile gloves</td>
			<td style="width:271px;">VWR, USA</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:271px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:247px;">5804 R / Serial number: 5805CI364293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Rubin Gal4 ines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ShibireTS UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 66600</td>
			<td>Provided by Carlos Ribeiro Group</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Soft brushes</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>For sorting anaesthetised fruit flies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Spectrophotometer plate reader</td>
			<td style="width:271px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:247px;">Multiskan Go 51119300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:271px;">Nikon</td>
			<td style="width:247px;">1016625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sucrose</td>
			<td style="width:271px;">Sidul, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Third-instar larvae (L3) rearing diet</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Timer</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tissue lyzer / bead beater</td>
			<td style="width:271px;">MP Biomedicals, USA</td>
			<td style="width:247px;">FastPrep-24 6004500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">TRPA1 UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 26264</td>
			<td>Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 &#8728;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Water bath</td>
			<td style="width:271px;">Sheldon Manufacturing Inc., USA</td>
			<td style="width:247px;">W20M-2 / 03068308 / 9021195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>51% Protein, 15% Carbohydrate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of macronutrients intake in a thermogenetic neuronal screen using drosophila larvae

Les comportements de recherche de nourriture et d’alimentation permettent aux animaux d’accéder à des sources d’énergie et de nutriments essentiels à leur développement, à leur santé et à leur forme physique. L’étude de la régulation neuronale de ces comportements est essentielle pour la compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires sous-jacents à l’homéostasie nutritionnelle. L’utilisation de modèles animaux génétiquement tractables tels que les vers, les mouches et les poissons facilite grandement ces types d’études. Au cours de la dernière décennie, la mouche des fruits Drosophila melanogaster a été utilisée comme un modèle animal puissant par les neurobiologistes qui étudient le contrôle neuronal des comportements d’alimentation et de recherche de nourriture. Bien que sans aucun doute précieux, la plupart des études examinent les mouches adultes. Ici, nous décrivons un protocole qui tire parti du système nerveux larvaire plus simple pour étudier les substrats neuronaux contrôlant des comportements d’alimentation lorsque les larves sont exposées à des régimes différents dans leur teneur en protéines et en glucides. Nos méthodes sont basées sur un test quantitatif colorimétrique d’alimentation sans choix, réalisé dans le cadre d’un écran d’activation thermogénétique neuronale. Comme lecture, la quantité de nourriture consommée par les larves sur un intervalle de 1 h a été employée une fois exposée à l’un des trois régimes colorant-marqués qui diffèrent dans leurs rapports protéines aux hydrates de carbone (P:C). L’efficacité de ce protocole est démontrée dans le cadre d’un criblage neurogénétique chez la drosophilelarvaire, en identifiant des populations neuronales candidates régulant la quantité de nourriture consommée dans des régimes de différentes qualité macronutriments. Nous avons également pu classer et regrouper les génotypes testés en classes phénotypiques. Sans compter qu’un bref examen des méthodes actuellement disponibles dans la littérature, les avantages et les limites de ces méthodes sont discutés et, également, quelques suggestions sont fournies au sujet de la façon dont ce protocole pourrait être adapté à d’autres expériences spécifiques.

Les larves de drosophile régulent leur apport en protéines au prix de l’ingestion de glucides en excès23 (diagramme schématique de la figure 2E). En fait, cette priorisation de l’apport en protéines a été observée chez de nombreux autres animaux et s’appelle la protéine tirant partide 24,25.
Tirant parti de cette réponse comportementale d’alimentation robu...

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Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Décrit ici est un protocole qui permet la quantification colorimétrique de la quantité de nourriture consommée dans un intervalle de temps défini par les larves de Drosophila melanogaster exposées à des régimes de qualité macronutriment différente. Ces tests sont menés dans le cadre d’un criblage thermogénétique neuronal.

Quantification de l’apport en macronutriments dans un écran neuronal thermogénétique à l’aide de larves de drosophiles

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

3.6K vues.  Monash University. Décrit ici est un protocole qui permet la quantification colorimétrique de la quantité de nourriture consommée dans un intervalle de temps défini par les larves de Drosophila melanogaster exposées à des régimes de qualité macronutriment différente. Ces tests sont menés dans le cadre d’un criblage thermogénétique neuronal.

Vidéo: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Nanoinjection paires et test d&#39;électrophysiologie à l&#39;écran de la bioactivité des composés en utilisant le Drosophila melanogaster Système de fibre géant

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

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Neurosciences

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appétitive apprentissage olfactif associatif en<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Capillaire Feeder Assay mesures prise alimentaire dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Quantification du comportement de toilettage de la drosophile

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Nouveau test pour froid dans nociception<em&gt; drosophile</em&gt; larves

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...