Wir danken dem Instituto Gulbenkian de Ciéncia (IGC) dafür, dass es uns Zugang zu einem Teil der in diesem Protokoll beschriebenen Experimentellen Ausrüstung verschafft hat. Diese Arbeit wurde von der Portugiesischen Stiftung für Wissenschaft und Technologie (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 und La Caixa HR17-00595 an PMD und von einem Australian Research Council Future Fellowship (FT170100259) an CKM unterstützt.

1. Zubereitung der Saccharose-Hefe-Diäten (SY)
<ol><li>Wiegen Sie alle trockenen Zutaten (Agar, Hefe, Saccharose) für die Makronährstoffausgleich und L3-Aufzucht diäten. Die Mengen in Gramm für jeden der Zutaten, die für die Zubereitung von 1 L Lebensmittel benötigt werden, sind in Abbildung 1Bangegeben. HINWEIS: Berücksichtigen Sie, dass ca. 13 ml Lebensmittel benötigt werden, um eine 60-mm-Petrischale zu füllen.</li>
	<li>Lösen Sie alle Zutaten in sterilem destilliertem Wasser (verwenden Sie ca. 50% der Gesamtmenge an Wasser, die für die Zubereitung des Lebensmittels benötigt wird) und rühren Sie das Medium für 5-10 min.</li>
	<li>Autoklav für 50 min.</li>
	<li>Nachdem die Medien abgekühlt werden können, fügen Sie nipagin und Propionsäurelösungen in einer Endkonzentration (v/v) von 3% bzw. 0,3% zu den Diäten hinzu. Zu den Makronährstoff-Ausgleichsdiäten fügen Sie blauen Lebensmittelfarbstoff zu einer Endkonzentration (v/v) von 1% hinzu. Vervollständigen Sie die Gesamtvolumina mit destilliertem Wasser.</li>
	<li>Gießen Sie die Essensdiäten vorsichtig auf 60 mm Petrischalen, so dass die Menge der gegossenen Lebensmittel in jedem der Teller ungefähr gleich ist. Beschriften Sie die Platten mit den P:C-Verhältnissen der Diäten. HINWEIS: Bereiten Sie die Makronährstoff-Ausgleichsdiäten am Tag des Fütterungstestes vor. Wenn nicht möglich, lagern Sie die vorbereiteten Diäten bei 4 °C, in einem versiegelten Behälter, für eine maximale Dauer von 3 Tagen. Längere Lagerzeiten machen die Ernährung zu trocken und hart, und die Larven können nicht in das Medium graben.</li>
</ol>2. Genetisches Kreuz der Elternlinien
HINWEIS: Verwenden Sie das Gal4/UAS-System21, um die genetischen Kreuze einzurichten. In diesem Protokoll wurden zur Aktivierung der neuronalen Funktion in bestimmten neuronalen Populationen weibliche Jungfrauen der UAS dTRPA1 Linie17 verwendet und an Männchen aus den Janelia Gal4-Linien gekreuzt (Abbildung 2A). Die verwendete genetische Kontrolle war die Nachkommenschaft einer Kreuzung zwischen der dTRPA1-Linie und einer "leeren GAL4"-Linie, die Gal4 in dem Vektor trägt, der zur Generierung der Rubin Gal4-Sammlung verwendet wird, aber ohne regulatorisches Fragment vorhanden ist (attP2)22. Um die neuronale Unterdrückung zu fördern, kann anstelle von dTRPA1 eine UAS-Linie verwendet werden, die ShibireTS20 kodiert.
<ol><li>Richten Sie 60-mm-Embryo-Sammelkäfige mit L3-Aufzucht-Diätplatten ein, ergänzt durch eine aktive Hefepaste.</li>
	<li>Übertragen Sie die erwachsenen UAS dTRPA1 Jungfrauen und Janelia Gal4 Männchen, im Alter von 5-8 Tagen, in die Embryo-Entnahme-Käfige und lassen Sie die Paarung für 24-48 h auftreten, bei 25 °C, mit 60% Luftfeuchtigkeit und einem 12:12 Hell-Dunkel-Zyklus (Abbildung 2A). Für 60 mm Embryo-Entnahmekäfige verwenden Sie etwa 100 jungfräuliche Weibchen und 30 Männchen pro Kreuz.</li>
	<li>Entfernen und entsorgen Sie am Ende der Paarungszeit die L3-Aufzuchtplatten, die in den genetischen Kreuzen verwendet werden. Ersetzen Sie sie durch frische L3-Aufzucht-Diätplatten, um die Eierlege und Larven-Inszenierung durchzuführen.</li>
</ol>3. Herstellung von Drittsternlarven (L3)
<ol><li>Übertragen Sie die gepaarten Erwachsenenfliegen auf frische L3-Aufzucht-Diätplatten und lassen Sie die Eiablage für 3-4 h bei 25 °C auftreten (Abbildung 2B). Stellen Sie sicher, dass alle Platten mit dem Genotyp, P:C-Verhältnis der Ernährung und dem Datum des Eides beschriftet sind. HINWEIS: Um Zeit zu sparen, führen Sie die Eiablage direkt in die L3-Aufzuchtdiät durch, wodurch eine zusätzliche Handhabung der Eier vermieden wird. Bei kleinen genetischen Screenings kann die Eiablage durch die Verwendung von Apfelsaft-Agarplatten optimiert werden.</li>
	<li>Am Ende der Eiablagezeit die Platten aus den Käfigen entfernen und mit Plastikdeckeln bedecken. Falls Hefeextrakt verwendet wird, um die L3-Aufzuchtplatten zu ergänzen, stellen Sie sicher, dass alle Resthefe am Ende der Eiablage entfernt wird. Dies ist wichtig, um eine ungleichmäßige Fütterung während des Larvenwachstums zu vermeiden. HINWEIS: Die gepaarten Erwachsenen können auf frische L3-Aufzucht-Diätplatten übertragen werden, so dass mehr Eierlege durchgeführt werden und experimentellere Larven erhalten werden können. Konsekutive Ei-Lays können mit den gleichen Erwachsenen während einer ganzen Arbeitswoche durchgeführt werden.</li>
	<li>Schätzen Sie die Anzahl der Eier pro Platte und halten Sie die Larvendichte auf maximal 200 Embryonen pro Platte. Diese Schätzung kann durch Zählen der Anzahl der Embryonen in einem Viertel der Platte durchgeführt werden. HINWEIS: Eine überfüllte Platte verzögert die Larvenentwicklung und wirkt sich auf das Larvenfütterungsverhalten aus.</li>
	<li>Inkubieren Sie die L3-Aufzuchtplatten bei 18 °C (zulässige Temperatur), 60% Luftfeuchtigkeit und einem 12:12-Licht-Dunkel-Zyklus, und lassen Sie die Larven 9 Tage lang wachsen (Abbildung 2B).</li>
	<li>Sammeln Sie am neunten Tag nach der Eiablage (AEL) drei Gruppen von 10 L3 von jedem der zu testenden Genotypen (und für die Repliken). Sammeln Sie zusätzlich Gruppen von 10 L3 für die "Null-Färbe-Lebensmittel"-Kontrolle. Stellen Sie sicher, dass die Larvensammlung während der gleichen Zeiträume des Tages erfolgt, an dem die Eilege durchgeführt werden (z. B. wenn die Eiablage zwischen 10 und 14 Uhr erfolgt ist, die Larven während des gleichen Zeitraums von 9 Tagen AEL sammeln) und so schonend wie möglich mit Zangen #5 oder einer Federgewichtszange durchgeführt wird. Die Larven wie im nächsten Schritt angegeben (3.6) direkt übertragen. HINWEIS: Die "Null-Färbe-Lebensmittel" Kontrolltiere sind Larven, die in der Fütterung Assay Erhalten Nahrung ohne Blaufarbstoff gegeben werden. Diese Kontrolle ist zwingend erforderlich, um die Hintergrundabsorption von Denlarvenextrakten zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie die gesammelten Experimentellen Larven auf KunststoffschalengewichtBoote mit 1 ml Wasser. Stellen Sie sicher, dass L3 und nicht L2 gesammelt wird, indem Sie den Anweisungen in Abbildung 3folgen. HINWEIS: Die Sammlung von L3 zu Kunststoffbooten, die Wasser oder 1x Phosphat-gepufferte Salzsäure (PBS) enthalten, ist wichtig, um Larven vor Beginn des Fütterungstestes gut hydratisiert zu halten. Dies ist besonders wichtig, wenn mehrere experimentelle L3-Gruppen aus verschiedenen Genotypen gleichzeitig gesammelt werden. Verfolgen Sie die Sammelreihenfolge für jede Gruppe, sodass Unterschiede in der Dauer der Nahrungsentzugszeit für jede Gruppe minimiert werden. Der Einsatz von Kunststoffbooten in diesem Schritt erleichtert den optionalen Schritt 4.3, da es Larven ermöglicht, direkt in das Wasserbad zu schwimmen.</li>
</ol>4. Thermogenetische Aktivierung und no-choice Fütterungstest
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Fütterungstests ungefähr zur gleichen Tageszeit durchzuführen, um mögliche Variationen im Zusammenhang mit den zirkadianen Rhythmen zu minimieren. Führen Sie auch immer die Kontrollexperimente (die Nachkommen der "leeren Gal4"-Linie zu UAS dTRPA1 und den "Null-Farbstoff-Lebensmittel"-Larven) parallel zu den Genotypen von Interesse.
<ol><li>Einrichten eines Inkubators auf 30 °C (nicht-zulässige Temperatur) und halten Sie hohe Luftfeuchtigkeit (mindestens 65%) larvende Austrocknung während des Assays zu vermeiden.</li>
	<li>Vor Beginn des Fütterungstestes die Temperatur der Assayplatten ausdemieren, indem Sie sie 30 min bei 30 °C erwärmen.</li>
	<li>(Optional) Hitzeschock der experimentellen Larven für 2 min in einem 37 ° C Wasserbad. Führen Sie diesen Schritt mit den Tieren in den Plastikgewichtsbooten durch, die etwas Wasser enthalten. HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts ist es, die neuronale Aktivierung zu intensivieren, indem das Abfeuern der Neuronen seit Beginn des Fütterungstestes gefördert wird.</li>
	<li>Halten Sie mehrere Timer für 1 h bereit. Die Anzahl der zu verwendenden Timer hängt von der Anzahl der getesteten Versuchsgruppen und von der Geschicklichkeit des Experimentators im Umgang mit Larven ab. HINWEIS: Die Verwendung mehrerer Timer ist entscheidend, um die Dauer des Assays für alle Genotypen konsistent zu halten.</li>
	<li>Entleeren Sie vorsichtig das Wasser aus den Plastikbooten und übertragen Sie die L3-Gruppen mit einer befeuchteten weichen Bürste vorsichtig von den Booten in die Mitte der Assayplatten. Legen Sie die Deckel der Platten zurück und starten Sie einen Timer für jede Platte (oder Gruppe von Platten), um genaue 1-h-Fütterungssitzungen beizubehalten.</li>
	<li>Lassen Sie die Larven für 1 h, bei 30 °C, im Dunkeln füttern (Abbildung 2C). HINWEIS: Die Leistung des Assays im Dunkeln ist wichtig, um Unterschiede in den visuellen Hinweisen über die Diäten hinweg zu kontrollieren, da sich die Diäten in Tönen unterscheiden, obwohl sie die gleiche Farbstoffkonzentration enthalten.</li>
	<li>Stoppen Sie den Fütterungstest, indem Sie die Platten in ein Eisbad übertragen. Drücken Sie das Eis so weit wie möglich nach unten, um eine stabile Oberfläche für die Platten zu schaffen. HINWEIS: Kalte Temperaturen fördern das Ende der Fütterung, indem sie das Bohr- und Grabenverhalten hemmen. Die meisten Larven werden die Teller nach einigen Minuten an den Oberfläche, erleichtert ihre Genesung in den folgenden Schritten.</li>
</ol>5. Lebensmittelfarbstoffextraktion
<ol><li>Bereiten Sie 2 ml Mikroröhren für jede Gruppe von 10 l3 getesteten Mikroröhren vor, die ungefähr die gleichen Mengen von 0,5 mm-Glasperlen (genug, um den unteren Teil des Mikrorohrs zu füllen) und 300 l eiskaltem Methanol enthalten. Halten Sie die Mikroröhren in der Kälte, mit einem Bankkühler. VORSICHT: Methanol ist leicht entzündlich und giftig. Befolgen Sie alle Sicherheitsverfahren, die für den Umgang mit diesem Reagenz empfohlen werden, einschließlich der Arbeit in einem gut belüfteten Bereich und dem Tragen von Nitrilhandschuhen. HINWEIS: Die Verwendung von Methanol ist wichtig, um die Larvenproben zu fixieren und Melanisierungsreaktionen in der Nagelhaut zu vermeiden.</li>
	<li>Mit #5 oder Federgewichtszangen die Gruppen von 10 L3 vorsichtig von den Futterprüfplatten bergen und auf die Deckel der Assayplatten übertragen, die etwas Wasser enthalten. Spülen Sie die Larven, um Lebensmittelreste auf ihrem Körper zu entfernen, während Sie die Larven sanft behandeln, um Verletzungen zu vermeiden. Führen Sie eine Aufzeichnung der Anzahl der Larven, die für jeden Genotyp pro Replikation zurückgewonnen wurden, so dass die durchschnittliche Menge der Nahrungsaufnahme pro Larve quantifiziert werden kann. HINWEIS: Verletzte Larven sollten entsorgt werden, da sie eine melanisierte Nagelhaut haben, da sie für die kolorimetrische Quantifizierung ungeeignet sind.</li>
	<li>Übertragen Sie die L3-Gruppen auf die in 5.1 hergestellten 2 ml Mikroröhren.</li>
	<li>Lyse die Larvengewebe, um die Lebensmittelfarbstoff aus dem Darm durch eine mechanische Lyse-Methode mit einem Gewebe Lyzer und Glasperlen in Schritt 5.1 hinzugefügt zu extrahieren. (wenn kein Gewebelyzer verfügbar ist, verwenden Sie einen homogenisierenden Stößel). Führen Sie diesen Schritt bevorzugt bei 4 °C(Abbildung 2D) aus. HINWEIS: Die Dauer dieses Schritts hängt von der verwendeten Ausrüstung ab. Mit einem herkömmlichen Gewebelyser ist 1 min Extraktion ausreichend. Bei zeitlichen Einschränkungen kann das Protokoll am Ende dieses Schritts angehalten und später fortgesetzt werden. Lagern Sie die Proben bei -20 °C.</li>
	<li>Übertragen Sie die Extrakte auf 1,5 ml Mikroröhren, indem Sie die 2 ml Mikroröhren direkt auf die neuen 1,5 ml Mikroröhren umkehren. Bei sanfter Arbeit bleiben die meisten Glasperlen am bodendes Ende des 2 ml Mikroröhren.</li>
	<li>Löschen Sie die Zellablagerungen, indem Sie die Extrakte zentrifugieren, mit einer maximalen Geschwindigkeit für 10 min, bei 4 °C.</li>
	<li>Sammeln Sie die Überräube, um 1,5 ml Mikroröhren zu reinigen. Wenn Zellablagerungen in den Überstand noch sichtbar sind, wiederholen Sie die Schritte 5.6 und 5.7.</li>
</ol>6. Farbmetrische Quantifizierung des Lebensmittelverbrauchs
<ol><li>Bereiten Sie Standardlösungen vor, um eine Kalibrierkurve zu erzeugen, indem Sie serielle 1:2-Verdünnungen in Methanol einer beginnenden blauen Farbstofflösung durchführen. Verwenden Sie als Rohling nur Methanol. Die Konzentration der Normen hängt von der Futteraufnahme der Tiere ab. HINWEIS: Im Falle des hier vorgestellten Pilotsiebes wurde eine Standardkurve verwendet, die durch Messung der Absorptionen von 8 seriellen Verdünnungen einer 2 L/ml-Blaufarbstofflösung in Methanol ermittelt wurde. Bei Bedarf die Konzentration dieser Lösungen erhöhen oder verringern, abhängig von der Farbstoffkonzentration der Versuchsproben.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 l der Versuchsproben (in Schritt 5.7), Normen und Rohling (Schritt 6.1) auf die Bohrungen einer 96-Well-Mikroplatte und messen Sie die Absorption bei 600 nm, mit einem Plattenleser(Abbildung 2E). Um die Hintergrundabsorption zu entfernen, messen Sie die Absorption von Extrakten aus Larven, die auf Lebensmitteln ohne Blaufärbung gefüttert werden, als "Null" für die Larvenextrakte ("Null-Farbstoff-Lebensmittelkontrolle").</li>
	<li>Generieren Sie eine Standardkurve und korrelieren Sie die Absorptionswerte für die Proben aus jeder experimentellen Larvengruppe mit der Menge der Nahrungsaufnahme (Volumen in ml). Ermitteln Des durchschnittlichen Nahrungsmittelverbrauchs pro Larve unter Berücksichtigung der Anzahl der für jede Gruppe gesammelten Larven in Schritt 5.2</li>
</ol>

<ol>
	<li>Raubenheimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature of nutrition - a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).</li><li>Carvahlo, M. J. a., Mirth, C. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+larval+feeding+circuit+in+Drosophila.">Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).</li><li>Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+measuring+feeding+rate+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).</li><li>Almeida-Carvalho, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ol1mpiad:+concordance+of+behavioural+faculties+of+stage+1+and+stage+3+Drosophila+larvae.">The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+larvae+make+nutritional+choices+that+minimize+developmental+time.">Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time.</a> Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).</li><li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+food+intake+in+Drosophila.">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+foraging+and+social+behavior+by+the+Drosophila+neuropeptide+Y-like+system.">Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system.</a> Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).</li><li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila.">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li><li>Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-regulation+of+cold-resistant+food+acquisition+by+insulin-+and+neuropeptide+Y-like+systems+in+Drosophila+melanogaster.">Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster.</a> Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Mit diesem Protokoll könnte man die Fähigkeit von Larven unter thermogenetischer Aktivierung bestimmter neuronaler Populationen testen, um die Aufnahmevonwerte von Proteinen und Kohlenhydraten, zwei hauptwichtigsten Makronährstoffen, zu regulieren, wenn sie Diäten unterschiedlicher P:C-Zusammensetzung ausgesetzt sind. Diese Methode wurde im Rahmen eines Larven-Vorscreenings getestet, um neuronale Populationen zu identifizieren, die mit der Kontrolle der Nahrungsaufnahme über Diäten unterschiedlicher Makronährstoff...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.
Figure 1&#160;was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.

Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Alle Tiere sind auf eine ausgewogene Ernährung angewiesen, um die notwendigen Nährstoffmengen für Überleben, Wachstum und Fortpflanzung zu erhalten1. Die Wahl dessen und wie viel zu essen wird durch eine Vielzahl von interagierenden Faktoren im Zusammenhang mit dem inneren Zustand des Tieres beeinflusst, wie die Sättigungsstufe, und Umweltbedingungen, wie Lebensmittelqualität2,3,4,5. Protein und Kohlenhydrate sind zwei wichtige Makronährstoffe und seine ausgewogene Aufnahme ist wichtig, um die physiologischen Prozesse der Tiere aufrechtzuerhalten. Daher ist das Verständnis der neuronalen Mechanismen, die das Fütterungsverhalten steuern und eine ausgewogene Aufnahme dieser Makronährstoffe aufrechterhalten, äußerst relevant. Dies liegt daran, dass lebensgeschichtliche Merkmale wie Lebensdauer, Fruchtbarkeit und metabolische Gesundheit direkt durch die Mengen der Proteinaufnahme6,7,8,9,10beeinflusst werden.
Die Verwendung einfacherer, haltbarer ergewöhnlicher Erregungsorganismen, die evolutionär konservierte Fütterungsgewohnheiten mit komplexen Tieren, einschließlich Säugetieren, aufweisen, ist für diese Art von Studien von wesentlicher Bedeutung. Wichtig ist, dass diese einfacheren Tiermodelle eine gute Gelegenheit bieten, komplexe biologische Fragen in einem kostspieligen, ethisch und technisch effektiveren Kontext zu sezieren. In den letzten Jahrzehnten war Drosophilamit seinem leistungsstarken genetischen Toolkit, komplizierten und stereotypen Verhalten und konservierter Architektur von peripheren und nährstoffsensorischen Mechanismen mit Säugetieren ein fruchtbares Modell für Verhaltensneurobiologen11. Letztlich besteht die Hoffnung, dass wir durch das Verständnis, wie die Nahrungsaufnahme in diesem Tier mit einem einfacheren Nervensystem reguliert wird, dann beginnen können, neuronale Fehlfunktionen zu entwirren, die menschlichen Essstörungen zugrunde liegen.
Die Untersuchung neuronaler Substrate für das Fütterungsverhalten hängt stark davon ab, dass sie gleichzeitig die Nahrungsaufnahme von Tieren messen können, während sie ihre neuronale Aktivität manipulieren. Aufgrund der minimalen Menge an aufgenommenen Lebensmitteln ist die Quantifizierung der Menge an Lebensmitteln, die von Fliegen gegessen werden, äußerst anspruchsvoll, und alle derzeit verfügbaren Methoden stellen erhebliche Einschränkungen dar. Daher ist der Goldstandard eine Kombination komplementärer Methoden12zu verwenden. Erwachsene Fliegen wurden historisch als genetisches und Verhaltensmodell bevorzugt. Dennoch, Drosophila Larven, bieten auch Möglichkeiten, neuronale Substrate Codierung Fütterung Verhalten zu untersuchen. Das Larven-Zentralnervensystem (ZNS) mit rund 12.000 Neuronen ist deutlich weniger komplex als das des Erwachsenen, der etwa 150.000 Neuronen enthält. Diese geringere Komplexität ist nicht nur numerisch, sondern auch funktional, da Larvenverhalten auf einfacheren Lokomotivfunktionen und sensorischen Systemen beruht. Trotz der scheinbaren Einfachheit ihres Nervensystems, Larven zeigen immer noch vollständige Fütterungsverhalten, und einige Methoden zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme in Drosophila Larven wurden beschrieben5,13,14,15. Durch die Kombination mit Manipulationen der neuronalen Aktivität, Drosophila Larven können ein hoch gradlierbares Modell für das Verständnis der neuronalen Regulation der Nahrungsaufnahme bilden.
Hier ist ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme in Larven, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Die Diäten, sogenannte Makronährstoffausgleichsdiäten, unterschieden sich in den Protein- und Kohlenhydratgehalten, insbesondere in Bezug auf die Protein-Kohlenhydrat-Verhältnisse (P:C) Verhältnisse: 1:1 (proteinreiche Ernährung), 1:4 (Zwischenernährung) und 1:16 (proteinarme Ernährung), wie in Abbildung 1Adargestellt. Kurz gesagt, wurde ein quantitativer No-Choice-Fütterungstest mit diesen drei isocalorischen Saccharose-Hefe (SY)-basierten Diäten mit einem blauen Lebensmittelfarbstoff gefärbt etabliert. Da Hefeextrakt und Saccharose als Protein- und Kohlenhydratquellen verwendet wurden und beide Kohlenhydrate enthalten, wurde eine Variation der P:C-Verhältnisse durch Änderung des Gleichgewichts dieser beiden Komponenten, wie zuvor beschrieben16 und wie in Abbildung 1Bangegeben, erreicht. Eine schematische Übersicht über das Protokoll mit den wichtigsten experimentellen Schritten ist in Abbildung 2verfügbar.
Dieses Protokoll wurde mit dem Ziel erstellt, die Rolle spezifischer neuronaler Populationen bei der Regulierung der Larvenfütterungsspiegel in Diäten unterschiedlicher P:C-Verhältnisse und im Rahmen eines thermogenetischen neuronalen Bildschirms zu untersuchen. Ein gut charakterisiertes neurogenetisches Werkzeug wurde aus der Transienten-Rezeptorpotential (TRP)-Familie verwendet: Drosophila Transient Receptor Potential Channel (dTRPA1), ein Temperatur- und spannungsgebundener Kationenkanal, der das Abfeuern von Aktionspotentialen ermöglicht, wenn Umgebungstemperaturen über 25 °C17steigen. Um die dTRPA1-Transgene auszudrücken, nutzten wir die Gal4-Linien, die auf cis-regulatorischenRegionen aus dem Im Rubin-Labor ansässigen Drosophila-Genom im Rahmen des FlyLight-Projekts am Janelia Research Campus18,19basieren.
Obwohl das Protokoll, hier beschrieben, im Kontext eines Aktivierungsbildschirms eingerichtet wurde, kann es vom Experimentator leicht an andere spezifische Bedürfnisse oder Interessen angepasst werden, nämlich einen Unterdrückungsbildschirm mit dem temperaturempfindlichen neuronalen Schalldämpfer ShibireTS20durchzuführen, alternativ zu dTRPA1. Diese und andere Anpassungen werden in den Protokoll- und Diskussionsabschnitten diskutiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2112px;" width="2113">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">1.5 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.690.001</td>
			<td style="width:1272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10xPBS</td>
			<td style="width:271px;">Nytech</td>
			<td style="width:247px;">MB18201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.0 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.695.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Greiner Bio-one, Austria</td>
			<td style="width:247px;">628161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">96 well microplates</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-204453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Bench cooler</td>
			<td style="width:271px;">Nalgene, USA</td>
			<td style="width:247px;">Labtop Cooler 5115-0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Blue food dye</td>
			<td style="width:271px;">Rayner, Billingshurst, UK</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Cell disruption media</td>
			<td style="width:271px;">Scientific Industries, Inc.</td>
			<td style="width:247px;">888-850-6208</td>
			<td>(0.5 mm glass beads)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Dish weight boats</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-201606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Embryo collection cage for 60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td style="width:247px;">FLY1212 (59-100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight forceps</td>
			<td style="width:271px;">BioQuip Products, USA</td>
			<td style="width:247px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fly food for stocks maintenance</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Forceps #5</td>
			<td style="width:271px;">Dumont</td>
			<td style="width:247px;">0108-5-PS</td>
			<td>Standard tips, INOX, 11cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">LMS Ltd, UK</td>
			<td style="width:247px;">Series 2, Model 230</td>
			<td>For thermogenetic feeding assay (30&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">Percival Scientific, USA</td>
			<td style="width:247px;">DR36NL</td>
			<td>To stage larvae (19&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Janelia lines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Detailed information in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Macronutrient balancing diets</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Methanol</td>
			<td style="width:271px;">VWR</td>
			<td style="width:247px;">CAS number: 67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:271px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:247px;">H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nitrile gloves</td>
			<td style="width:271px;">VWR, USA</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:271px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:247px;">5804 R / Serial number: 5805CI364293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Rubin Gal4 ines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ShibireTS UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 66600</td>
			<td>Provided by Carlos Ribeiro Group</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Soft brushes</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>For sorting anaesthetised fruit flies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Spectrophotometer plate reader</td>
			<td style="width:271px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:247px;">Multiskan Go 51119300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:271px;">Nikon</td>
			<td style="width:247px;">1016625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sucrose</td>
			<td style="width:271px;">Sidul, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Third-instar larvae (L3) rearing diet</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Timer</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tissue lyzer / bead beater</td>
			<td style="width:271px;">MP Biomedicals, USA</td>
			<td style="width:247px;">FastPrep-24 6004500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">TRPA1 UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 26264</td>
			<td>Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 &#8728;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Water bath</td>
			<td style="width:271px;">Sheldon Manufacturing Inc., USA</td>
			<td style="width:247px;">W20M-2 / 03068308 / 9021195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>51% Protein, 15% Carbohydrate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of macronutrients intake in a thermogenetic neuronal screen using drosophila larvae

Futter- und Fütterungsverhalten ermöglichen es Tieren, auf Energiequellen und Nährstoffe zuzugreifen, die für ihre Entwicklung, Gesundheit und Fitness unerlässlich sind. Die Untersuchung der neuronalen Regulation dieser Verhaltensweisen ist für das Verständnis der physiologischen und molekularen Mechanismen, die der Ernährungshomöostase zugrunde liegen, von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung genetisch bestückbarer Tiermodelle wie Würmer, Fliegen und Fische erleichtert diese Art von Studien erheblich. In den letzten zehn Jahren wurde die Fruchtfliege Drosophila melanogaster von Neurobiologen als mächtiges Tiermodell verwendet, die die neuronale Kontrolle von Fütterungs- und Futterverhalten untersuchen. Obwohl zweifellos wertvoll, untersuchen die meisten Studien erwachsene Fliegen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das das einfachere Larvennervensystem nutzt, um neuronale Substrate zu untersuchen, die das Fütterungsverhalten kontrollieren, wenn Larven Diäten ausgesetzt sind, die sich in ihrem Protein- und Kohlenhydratgehalt unterscheiden. Unsere Methoden basieren auf einem quantitativen kolorimetrischen No-Choice-Fütterungstest, der im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Aktivierungsbildschirms durchgeführt wird. Als Auslese wurde die Menge an Lebensmitteln, die von Larven über ein Intervall von 1 h gegessen wurden, verwendet, wenn sie einer der drei mit Farbstoffen gekennzeichneten Diäten ausgesetzt wurde, die sich in ihrem Protein-Zu-Kohlenhydrat-Verhältnis (P:C) unterscheiden. Die Wirksamkeit dieses Protokolls wird im Kontext eines neurogenetischen Bildschirms bei Larven Drosophilademonstriert, indem kandidaten neuronale Populationen identifiziert werden, die die Menge der Nahrung regulieren, die in Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität gegessen wird. Wir waren auch in der Lage, die getesteten Genotypen in phänotypische Klassen zu klassifizieren und zu gruppieren. Neben einem kurzen Überblick über die derzeit verfügbaren Methoden in der Literatur werden die Vorteile und Grenzen dieser Methoden diskutiert und es werden auch einige Vorschläge gemacht, wie dieses Protokoll an andere spezifische Experimente angepasst werden könnte.

Drosophila-Larven regulieren ihre Proteinzufuhr auf Kosten der Einnahme überschüssiger Kohlenhydrate23 (schematische Darstellung in Abbildung 2E). Tatsächlich wurde diese Priorisierung der Proteinzufuhr bei vielen anderen Tieren beobachtet und wird als Protein-Hebel24,25bezeichnet.
Unter Ausnutzung dieser robusten Fütterungsverhaltensreaktion wurde ein verhaltensbasiert...

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Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Beschrieben hier ist ein Protokoll, das die kolorimetrische Quantifizierung der Menge der Nahrung ermöglicht, die innerhalb eines definierten Zeitintervalls von Drosophila melanogaster Larven gegessen wird, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Diese Assays werden im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Bildschirms durchgeführt.

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

3.6K Aufrufe.  Monash University. Beschrieben hier ist ein Protokoll, das die kolorimetrische Quantifizierung der Menge der Nahrung ermöglicht, die innerhalb eines definierten Zeitintervalls von Drosophila melanogaster Larven gegessen wird, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Diese Assays werden im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Bildschirms durchgeführt.

Serie: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Gepaart Nanoinjection und Elektrophysiologie-Test zum Screening auf Bioaktivität der Verbindungen unter Verwendung des Drosophila melanogaster Riesen-Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Die kapillare feeder Assay misst die Nahrungsaufnahme in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Quantifizierung von Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Neuartige Assay für kalte Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...