Ringraziamo l'Instituto Gulbenkian de Ciência (CIG) per averci fornito l'accesso a una parte delle attrezzature sperimentali descritte in questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione portoghese per la scienza e la tecnologia (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 e La Caixa HR17-00595 a PMD e da un Australian Research Council Future Fellowship (FT170100259) a CKM.

1. Preparazione delle diete di lievito di saccarosio (SY)
<ol><li>Pesare tutti gli ingredienti secchi (agar, lievito, saccarosio) per il bilanciamento dei macronutrienti e le diete di allevamento L3. Le quantità in grammi per ciascuno degli ingredienti necessari per preparare 1 L di cibo sono indicate nella figura 1B. NOTA: Tenere conto del fatto che sono necessari circa 13 mL di cibo per riempire una piastra di Petri da 60 mm.</li>
	<li>Sciogliere tutti gli ingredienti in acqua distillata sterile (utilizzare circa il 50% del volume totale di acqua necessaria per preparare il cibo) e mescolare il mezzo per 5-10 minuti.</li>
	<li>Autoclave per 50 min.</li>
	<li>Dopo aver permesso ai mezzi di raffreddarsi, aggiungere soluzioni di nipagin e acido propionico alle diete, ad una concentrazione finale (v/v) rispettivamente del 3% e dello 0,3%. Alle diete equilibranti macronutrienti, aggiungere colorante alimentare blu a una concentrazione finale (v/v) dell'1%. Completa i volumi totali con acqua distillata.</li>
	<li>Versare con cura le diete alimentari a 60 mm di piastre di Petri, in modo che la quantità di cibo versato sia approssimativamente la stessa in ciascuno dei piatti. Etichettare le piastre con i rapporti P:C delle diete. NOTA: Preparare le diete di bilanciamento dei macronutrienti il giorno del test di alimentazione. Se non è possibile, conservare le diete preparate a 4 °C, in un contenitore sigillato, per una durata massima di 3 giorni. Periodi di conservazione più lunghi rendono la dieta troppo secca e dura e le larve non possono scavare nel mezzo.</li>
</ol>2. Croce genetica delle linee parentali
NOTA: Utilizzare il sistema Gal4/UAS21 per impostare le croci genetiche. In questo protocollo, al fine di attivare la funzione neuronale in specifiche popolazioni neuronali, le vergini femminili della linea17 UAS dTRPA1 sono state utilizzate e incrociate ai maschi dalle linee Janelia Gal4 (Figura 2A). Il controllo genetico utilizzato era la progenie di un incrocio tra la linea dTRPA1 e una linea "GAL4 vuota", che trasporta Gal4 nel vettore utilizzato per generare la collezione Rubin Gal4 ma senza frammento regolatore presente (attP2)22. Per promuovere la soppressione neuronale, è possibile utilizzare una linea UAS che codifica ShibireTS20, invece di dTRPA1.
<ol><li>Impostare gabbie per la raccolta degli embrioni da 60 mm con piastre dietetiche per l'allevamento L3, integrate con una pasta di lievito attiva.</li>
	<li>Trasferire le vergini femmine UAS dTRPA1 adulte e i maschi Janelia Gal4, di età compresa tra 5 e 8 giorni, nelle gabbie di raccolta degli embrioni e consentire l'accoppiamento per 24-48 ore, a 25 °C, con il 60% di umidità e un ciclo luce-buio 12:12(Figura 2A). Per gabbie di raccolta degli embrioni da 60 mm, utilizzare circa 100 femmine vergini e 30 maschi per croce.</li>
	<li>Alla fine del periodo di accoppiamento, rimuovere e scartare le piastre dietetiche di allevamento L3 utilizzate nelle croci genetiche. Sostituirli con piatti freschi di dieta per l'allevamento L3, al fine di eseguire le deposizioni delle uova e la stadiazione larvale.</li>
</ol>3. Preparazione di larve di terza stella (L3)
<ol><li>Trasferire le mosche adulte accoppiate su piatti freschi di dieta per l'allevamento L3 e consentire la deposizione delle uova per 3-4 ore, a 25 °C(Figura 2B). Assicurarsi che tutti i piatti siano etichettati con il genotipo, rapporto P:C della dieta e data della deposizione delle uova. NOTA: Per risparmiare tempo, eseguire la deposizione delle uova direttamente nella dieta di allevamento L3, che evita una maggiore manipolazione delle uova. Nel caso di screening genetici su piccola scala, l'ottimizzazione della deposizione delle uova può essere ottenuta utilizzando piastre di agar di succo di mela.</li>
	<li>Alla fine del periodo di deposizione delle uova, rimuovere i piatti dalle gabbie e coprirli con coperchi di plastica. Nel caso in cui l'estratto di lievito sia utilizzato per integrare le piastre di allevamento L3, assicurarsi di rimuovere tutto il lievito residuo alla fine della deposizione delle uova. Questo è importante per evitare un'alimentazione non uniforme durante la crescita larvale. NOTA: Gli adulti accoppiati possono essere trasferiti su piatti di dieta di allevamento L3 freschi, quindi vengono eseguiti più deposizioni di uova e si possono ottenere larve più sperimentali. Gli egg-deponenti consecutivi possono essere eseguiti con gli stessi adulti durante un'intera settimana lavorativa.</li>
	<li>Stimare il numero di uova per piastra e mantenere la densità larvale a un massimo di 200 embrioni per piastra. Questa stima può essere fatta contando il numero di embrioni in un quarto della piastra. NOTA: Una piastra sovraffollata ritarderà lo sviluppo larvale e influenzerà i comportamenti di alimentazione larvale.</li>
	<li>Incubare le piastre di allevamento L3 a 18 °C (temperatura permissiva), umidità del 60% e un ciclo luce-buio 12:12 e consentire alle larve di crescere per 9 giorni(Figura 2B).</li>
	<li>Il nono giorno dopo la deposizione delle uova (AEL), raccogliere tre gruppi di 10 L3 da ciascuno dei genotipi (e per le repliche) da testare. Inoltre, raccogli gruppi di 10 L3 per il controllo "cibo a colorante zero". Assicurarsi che la raccolta delle larve sia fatta durante periodi di tempo equivalenti del giorno utilizzato per fare la deposizione delle uova (ad esempio, se la deposizione delle uova si è verificata tra le 10:00 e le 14:00, raccogliere le larve durante lo stesso periodo di tempo 9 giorni AEL) e viene eseguita, il più delicatamente possibile, utilizzando forcelle #5 o una forcelle di peso piuma. Trasferire direttamente le larve come indicato nel passaggio successivo (3.6). NOTA: Gli animali di controllo "cibo a colorante zero" sono larve che nel saggio di alimentazione ricevono cibo senza colorante blu. Questo controllo è imperativo per rimuovere l'assorbanza di fondo degli estratti larvali.</li>
	<li>Trasferire le larve sperimentali raccolte su barche di peso per piatti di plastica contenenti 1 mL di acqua. Assicurarsi che L3 sia raccolto, e non L2, seguendo le indicazioni fornite nella figura 3. NOTA: La raccolta di L3 su barche di plastica contenenti acqua o 1x soluzione salina tamponata da fosfati (PBS), è importante per mantenere le larve ben idratate prima dell'inizio del test di alimentazione. Ciò è particolarmente importante se vengono raccolti contemporaneamente diversi gruppi sperimentali L3 di diversi genotipi. Tieni traccia dell'ordine di raccolta per ogni gruppo, in modo che le differenze nella durata della privazione di cibo per ogni gruppo siano ridotte al minimo. L'uso di barche di plastica in questo passaggio facilita il passaggio opzionale 4.3 in quanto consente alle larve di galleggiare direttamente nel bagno d'acqua.</li>
</ol>4. Attivazione termogenetica e test di alimentazione a scelta
NOTA: Si raccomanda di eseguire i test di alimentazione all'incirca nello stesso momento della giornata per ridurre al minimo le possibili variazioni legate ai ritmi circadiani. Inoltre, eseguire sempre gli esperimenti di controllo (la progenie della linea "Gal4 vuota" attraversata fino a UAS dTRPA1 e le larve "cibo a colorante zero", in parallelo con i genotipi di interesse.
<ol><li>Impostare un incubatore a 30 °C (temperatura non permissiva) e mantenere alti livelli di umidità (almeno il 65%) per evitare la disidratazione larvale durante il saggio.</li>
	<li>Prima di iniziare il saggio di alimentazione, equilibrare la temperatura delle piastre di dosaggio riscaldandole a 30 °C per 30 minuti.</li>
	<li>(Facoltativo) Shock termico le larve sperimentali per 2 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Eseguire questo passaggio con gli animali nelle barche di peso di plastica contenenti un po 'd'acqua. NOTA: Lo scopo di questo passaggio è quello di intensificare l'attivazione neuronale promuovendo il fuoco dei neuroni dall'inizio del test di alimentazione.</li>
	<li>Tieni pronti più timer per 1 h. Il numero di timer da utilizzare dipende dal numero di gruppi sperimentali testati e dal livello di abilità dello sperimentatore nella manipolazione delle larve. NOTA: L'uso di più timer è fondamentale per mantenere la durata del saggio coerente per tutti i genotipi.</li>
	<li>Scolare con cura l'acqua dalle barche di plastica e, utilizzando una spazzola morbida inumidita, trasferire delicatamente i gruppi L3 dalle barche al centro delle piastre di dosaggio. Rimettere i coperchi delle piastre e avviare un timer per ogni piastra (o gruppo di piastre) per mantenere accurate sessioni di alimentazione di 1 h.</li>
	<li>Lasciare che le larve si alimentino per 1 h, a 30 °C, al buio(Figura 2C). NOTA: Le prestazioni del saggio al buio sono importanti da controllare per le differenze nei segnali visivi tra le diete, poiché le diete differiranno nei toni, anche se contengono la stessa concentrazione di coloranti.</li>
	<li>Interrompere il saggio di alimentazione trasferendo le piastre in un bagno di ghiaccio. Premere il ghiaccio il più possibile per fornire una superficie stabile per le piastre. NOTA: Le temperature fredde promuoveranno la fine dell'alimentazione inibendo comportamenti di scavo e scavo. La maggior parte delle larve farà emergere i piatti alimentari dopo alcuni minuti, facilitando il loro recupero nei seguenti passaggi.</li>
</ol>5. Estrazione di coloranti alimentari
<ol><li>Preparare 2 microtubi mL per ciascun gruppo di 10 L3 testati, contenenti approssimativamente le stesse quantità di perline di vetro da 0,5 mm (sufficienti a riempire la parte inferiore del microtubo) e 300 μL di metanolo ghiacciato. Tenere i microtubi al freddo, utilizzando un refrigeratore da banco. ATTENZIONE: Il metanolo è altamente infiammabile e tossico. Seguire tutte le procedure di sicurezza raccomandate per la manipolazione di questo reagente, incluso lavorare in un'area ben ventilata e indossare guanti in nitrile. NOTA: L'uso del metanolo è importante per fissare i campioni larvali ed evitare reazioni di melanizzazione nella cuticola.</li>
	<li>Utilizzando #5 o forcep di peso piuma, recuperare con cura i gruppi di 10 L3 dalle piastre di dosaggio di alimentazione e trasferirli nei coperchi delle piastre di dosaggio contenenti un po 'd'acqua. Risciacquare le larve per rimuovere eventuali detriti alimentari sui loro corpi mentre maneggiano delicatamente le larve per evitare lesioni. Tenere un registro del numero di larve recuperate per ogni genotipo per replica, in modo che la quantità media di assunzione di cibo per larva possa essere quantificata. NOTA: Le larve ferite devono essere scartate in quanto avranno cuticola melanizzata, non essendo adatte alla quantificazione colorimetrica.</li>
	<li>Trasferire i gruppi L3 ai microtubi da 2 mL preparati in 5.1.</li>
	<li>Liscivia i tessuti larvali per estrarre il colorante alimentare dalle viscere con un metodo meccanico di lisi utilizzando un liscivia tissutale e perline di vetro aggiunte nel passaggio 5.1. (se un listore tissutale non è disponibile, utilizzare un pestello omogeneizzante). Esegua preferenzialmentementementementemente a 4 °C (Figura 2D). NOTA: La durata di questo passaggio dipenderà dall'attrezzatura utilizzata. Utilizzando un liscitrie tissutale convenzionale, è sufficiente un'estrazione di 1 minuto. In caso di costrizioni di tempo, il protocollo può essere messo in pausa alla fine di questo passaggio e proceduto in seguito. Conservare i campioni a -20 °C.</li>
	<li>Trasferire gli estratti in microtubi da 1,5 mL puliti, invertendo direttamente i microtubi da 2 mL sui nuovi microtubi da 1,5 mL. Se eseguita delicatamente, la maggior parte delle perline di vetro rimarrà nella parte inferiore del microtubo da 2 mL.</li>
	<li>Sgombro i detriti cellulari centrifugando gli estratti, ad una velocità massima di 10 min, a 4 °C.</li>
	<li>Raccogliere i supernatanti per pulire microtubi da 1,5 mL. Se i detriti cellulari sono ancora visibili nei supernatanti, ripetere i passaggi 5.6 e 5.7.</li>
</ol>6. Quantificazione colorimetrica del consumo alimentare
<ol><li>Preparare soluzioni standard, per generare una curva di calibrazione, eseguendo diluizioni seriali 1:2 in metanolo di una soluzione di colorante blu iniziale. Come vuoto, usa solo metanolo. La concentrazione delle norme dipende dai livelli di assunzione di cibo degli animali. NOTA: Nel caso dello schermo pilota qui presentato, poiché le concentrazioni di coloranti ottenute per gli estratti larvali variavano da 0,02 a 1,93 μL/mL, è stata utilizzata una curva standard ottenuta misurando le assorbanze di 8 diluizioni seriali di una soluzione di colorante blu da 2 μL/mL in metanolo. Se necessario, aumentare o diminuire la concentrazione di queste soluzioni, a seconda della concentrazione di coloranti dei campioni sperimentali.</li>
	<li>Trasferire 100 μL dei campioni sperimentali (ottenuti nella fase 5.7), standard e bianco (fase 6.1) ai pozzi di una micropiastra a 96 pozzi e misurare l'assorbanza a 600 nm, utilizzando un lettore di piastre(figura 2E). Per rimuovere l'assorbanza di fondo, misurare l'assorbanza degli estratti ottenuti dalle larve alimentate con cibo senza colorante blu come "zero" per gli estratti larvali ("controllo degli alimenti a colorante zero).</li>
	<li>Generare una curva standard e correlare i valori di assorbanza ottenuti per i campioni da ogni gruppo larvale sperimentale con la quantità di assunzione di cibo (volume in mL). Trova il consumo medio di cibo per larva tenendo conto del numero di larve raccolte per ogni gruppo nel passaggio 5.2</li>
</ol>

<ol>
	<li>Raubenheimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature of nutrition - a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).</li><li>Carvahlo, M. J. a., Mirth, C. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+larval+feeding+circuit+in+Drosophila.">Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).</li><li>Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+measuring+feeding+rate+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).</li><li>Almeida-Carvalho, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ol1mpiad:+concordance+of+behavioural+faculties+of+stage+1+and+stage+3+Drosophila+larvae.">The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+larvae+make+nutritional+choices+that+minimize+developmental+time.">Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time.</a> Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).</li><li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+food+intake+in+Drosophila.">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+foraging+and+social+behavior+by+the+Drosophila+neuropeptide+Y-like+system.">Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system.</a> Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).</li><li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila.">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li><li>Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-regulation+of+cold-resistant+food+acquisition+by+insulin-+and+neuropeptide+Y-like+systems+in+Drosophila+melanogaster.">Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster.</a> Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Con questo protocollo, si potrebbe testare la capacità delle larve sotto l'attivazione termogenetica di specifiche popolazioni neuronali di regolare i livelli di assunzione di proteine e carboidrati, due principali macronutrienti, quando esposte a diete di diversa composizione P:C. Questo metodo è stato testato nel contesto di uno screening preliminare larvale con l'obiettivo di identificare le popolazioni neuronali associate al controllo dell'assunzione di cibo attraverso diete di diversa qualità macronutriente. Ques...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.
Figure 1&#160;was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.

Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Tutti gli animali dipendono da una dieta equilibrata per acquisire le quantità necessarie di nutrienti per la sopravvivenza, la crescita e la riproduzione1. La scelta di cosa e quanto mangiare è influenzata da una moltitudine di fattori interagenti legati allo stato interno dell'animale, come il livello di sazietà, e le condizioni ambientali, come la qualità delcibo 2,3,4,5. Proteine e carboidrati sono due dei principali macronutrienti e il suo apporto equilibrato è essenziale per sostenere i processi fisiologici degli animali. Pertanto, la comprensione dei meccanismi neurali che controllano i comportamenti di alimentazione e sostengono un'assunzione equilibrata di questi macronutrienti è estremamente rilevante. Questo perché i tratti della storia della vita come la durata della vita, la fecondità e la salute metabolica sono direttamente influenzati dai livelli di assunzione di proteine6,7,8,9,10.
L'uso di organismi più semplici e trattabili che mostrano abitudini alimentari evolutivamente conservate con animali complessi, compresi i mammiferi, è essenziale per questo tipo di studi. È importante sottolineare che questi modelli animali più semplici offrono una buona opportunità per sezionare complesse questioni biologiche in un contesto costoso, eticamente e tecnicamente più efficace. Negli ultimi decenni, Drosophila, conil suo potente toolkit genetico, il comportamento intricato e stereotipato e l'architettura conservata dei meccanismi periferici e di rilevamento dei nutrienti con i mammiferi, è stato un modello fruttuoso per i neurobiologi comportamentali11. In definitiva, la speranza è che comprendendo come l'assunzione di cibo sia regolata in questo animale, con un sistema nervoso più semplice, possiamo quindi iniziare a districare i malfunzionamenti neuronali alla base dei disturbi alimentari umani.
Lo studio dei substrati neuronali per i comportamenti di alimentazione dipende profondamente dalla capacità di misurare contemporaneamente l'assunzione di cibo degli animali manipolando la loro attività neuronale. A causa delle quantità minime di cibo ingerito, quantificare la quantità di cibo mangiato dalle mosche è estremamente impegnativo e tutti i metodi attualmente disponibili presentano limitazioni significative. Pertanto, il gold standard è quello di utilizzare una combinazione di metodologie complementari12. Le mosche adulte sono state storicamente favorite come modello genetico e comportamentale. Tuttavia, le larve di Drosophila offrono anche l'opportunità di indagare i substrati neuronali che codificano il comportamento di alimentazione. Il sistema nervoso centrale larvale (SNC), con circa 12.000 neuroni, è significativamente meno complesso di quello dell'adulto, che contiene circa 150.000 neuroni. Questa minore complessità non è solo numerica ma anche funzionale, poiché i comportamenti larvali si basano su funzioni locomotiva più semplici e sistemi sensoriali. Nonostante l'apparente semplicità del loro sistema nervoso, le larve mostrano ancora comportamenti di alimentazione completi e alcuni metodi per quantificare l'ingestione di cibo nelle larve di Drosophila sono statidescritti 5,13,14,15. Abbinandosi a manipolazioni dell'attività neuronale, le larve di Drosophila possono costituire un modello altamente trattabile per comprendere la regolazione neurale dell'assunzione di cibo.
Fornito qui è un protocollo dettagliato per quantificare l'assunzione di cibo nelle larve esposte a diete di diversa qualità macronutriente. Le diete, le cosiddette diete equilibranti macronutrienti, differivano nel contenuto di proteine e carboidrati, in particolare per quanto riguarda i rapporti proteina-carboidrati (P:C): 1:1 (dieta ricca di proteine), 1:4 (dieta intermedia) e 1:16 (dieta povera di proteine), come mostrato nella figura 1A. In breve, è stato stabilito un saggio quantitativo di alimentazione senza scelta utilizzando queste tre diete a base di lievito di saccarosio isocalorico (SY) tinte con un colorante alimentare blu. Poiché l'estratto di lievito e il saccarosio sono stati utilizzati come fonti proteiche e di carboidrati ed entrambi contengono carboidrati, la variazione dei rapporti P:C è stata ottenuta modificando l'equilibrio di questi due componenti, come descritto inprecedenza 16 e come indicato nella figura 1B. Una panoramica schematica del protocollo, che mostra i principali passaggi sperimentali, è disponibile nella figura 2.
Questo protocollo è stato stabilito con l'obiettivo di indagare il ruolo di specifiche popolazioni neuronali sulla regolazione dei livelli di alimentazione larvale nelle diete di diversi rapporti P:C e nel contesto di uno schermo neuronale termogenetico. Uno strumento neurogenetico ben caratterizzato è stato utilizzato dalla famiglia TRP (Transient Receptor Potential): Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), che è un canale di temperatura e tensione-gated, consentendo la cottura di potenziali d'azione quando le temperature ambientali salgono sopra i 25 °C17. Per esprimere il transgene dTRPA1, abbiamo sfruttato le linee Gal4 basate sulle regioni regolatorie cisdel genoma drosophila, stabilite nel laboratorio Rubin, nell'ambito del progetto FlyLight presso Janelia Research Campus18,19.
Sebbene il protocollo, qui descritto, sia stato stabilito nel contesto di una schermata di attivazione, può essere facilmente adattato dallo sperimentatore ad altre esigenze o interessi specifici, vale a dire eseguire uno schermo di soppressione utilizzando il silenziatore neuronale sensibile alla temperatura ShibireTS20, in alternativa a dTRPA1. Questo e altri adattamenti sono discussi nelle sezioni relative al protocollo e alle discussioni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2112px;" width="2113">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">1.5 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.690.001</td>
			<td style="width:1272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10xPBS</td>
			<td style="width:271px;">Nytech</td>
			<td style="width:247px;">MB18201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.0 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.695.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Greiner Bio-one, Austria</td>
			<td style="width:247px;">628161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">96 well microplates</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-204453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Bench cooler</td>
			<td style="width:271px;">Nalgene, USA</td>
			<td style="width:247px;">Labtop Cooler 5115-0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Blue food dye</td>
			<td style="width:271px;">Rayner, Billingshurst, UK</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Cell disruption media</td>
			<td style="width:271px;">Scientific Industries, Inc.</td>
			<td style="width:247px;">888-850-6208</td>
			<td>(0.5 mm glass beads)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Dish weight boats</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-201606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Embryo collection cage for 60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td style="width:247px;">FLY1212 (59-100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight forceps</td>
			<td style="width:271px;">BioQuip Products, USA</td>
			<td style="width:247px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fly food for stocks maintenance</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Forceps #5</td>
			<td style="width:271px;">Dumont</td>
			<td style="width:247px;">0108-5-PS</td>
			<td>Standard tips, INOX, 11cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">LMS Ltd, UK</td>
			<td style="width:247px;">Series 2, Model 230</td>
			<td>For thermogenetic feeding assay (30&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">Percival Scientific, USA</td>
			<td style="width:247px;">DR36NL</td>
			<td>To stage larvae (19&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Janelia lines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Detailed information in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Macronutrient balancing diets</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Methanol</td>
			<td style="width:271px;">VWR</td>
			<td style="width:247px;">CAS number: 67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:271px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:247px;">H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nitrile gloves</td>
			<td style="width:271px;">VWR, USA</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:271px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:247px;">5804 R / Serial number: 5805CI364293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Rubin Gal4 ines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ShibireTS UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 66600</td>
			<td>Provided by Carlos Ribeiro Group</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Soft brushes</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>For sorting anaesthetised fruit flies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Spectrophotometer plate reader</td>
			<td style="width:271px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:247px;">Multiskan Go 51119300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:271px;">Nikon</td>
			<td style="width:247px;">1016625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sucrose</td>
			<td style="width:271px;">Sidul, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Third-instar larvae (L3) rearing diet</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Timer</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tissue lyzer / bead beater</td>
			<td style="width:271px;">MP Biomedicals, USA</td>
			<td style="width:247px;">FastPrep-24 6004500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">TRPA1 UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 26264</td>
			<td>Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 &#8728;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Water bath</td>
			<td style="width:271px;">Sheldon Manufacturing Inc., USA</td>
			<td style="width:247px;">W20M-2 / 03068308 / 9021195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>51% Protein, 15% Carbohydrate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of macronutrients intake in a thermogenetic neuronal screen using drosophila larvae

I comportamenti di foraggiamento e alimentazione consentono agli animali di accedere a fonti di energia e nutrienti essenziali per il loro sviluppo, salute e fitness. Studiare la regolazione neuronale di questi comportamenti è essenziale per la comprensione dei meccanismi fisiologici e molecolari alla base dell'omeostasi nutrizionale. L'uso di modelli animali geneticamente trattabili come vermi, mosche e pesci facilita notevolmente questo tipo di studi. Nell'ultimo decennio, la mosca della frutta Drosophila melanogaster è stata utilizzata come potente modello animale dai neurobiologi che indagano il controllo neuronale dei comportamenti di alimentazione e foraggiamento. Sebbene indubbiamente prezioso, la maggior parte degli studi esamina le mosche adulte. Qui, descriviamo un protocollo che sfrutta il sistema nervoso larvale più semplice per indagare i substrati neuronali che controllano i comportamenti di alimentazione quando le larve sono esposte a diete diverse nel loro contenuto di proteine e carboidrati. I nostri metodi si basano su un saggio quantitativo colorimetrico di alimentazione senza scelta, eseguito nel contesto di uno schermo neuronale termogenetico-attivazione. Come lettura, la quantità di cibo mangiata dalle larve per un intervallo di 1 h è stata utilizzata quando esposta a una delle tre diete etichettate con colorante che differiscono nei rapporti tra proteine e carboidrati (P:C). L'efficacia di questo protocollo è dimostrata nel contesto di uno schermo neurogenetico in Drosophila larvale, identificando popolazioni neuronali candidate che regolano la quantità di cibo mangiato in diete di diversa qualità macronutriente. Siamo stati anche in grado di classificare e raggruppare i genotipi testati in classi fenotipiche. Oltre ad una breve rassegna dei metodi attualmente disponibili in letteratura, vengono discussi i vantaggi e i limiti di questi metodi e, inoltre, vengono forniti alcuni suggerimenti su come questo protocollo potrebbe essere adattato ad altri esperimenti specifici.

Le larve di Drosophila regolano il loro apporto proteico a costo di ingerire carboidrati ineccesso 23 (grafico schematico nella figura 2E). In realtà, questa priorità dell'assunzione di proteine è stata osservata in molti altri animali ed è chiamata proteina chesfrutta 24,25.
Sfruttando questa robusta risposta comportamentale alimentare, è stato progettato uno schermo ...

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Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Qui descritto è un protocollo che consente la quantificazione colorimetrica della quantità di cibo mangiata entro un intervallo di tempo definito dalle larve di Drosophila melanogaster esposte a diete di diversa qualità macronutriente. Questi test sono condotti nel contesto di uno schermo termogenetico neuronale.

Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

3.6K Views.  Monash University. Qui descritto è un protocollo che consente la quantificazione colorimetrica della quantità di cibo mangiata entro un intervallo di tempo definito dalle larve di Drosophila melanogaster esposte a diete di diversa qualità macronutriente. Questi test sono condotti nel contesto di uno schermo termogenetico neuronale.

Video: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Nanoinjection associato e test Elettrofisiologia allo schermo per la bioattività dei composti con il Drosophila melanogaster Sistema Fiber Giant

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

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Neuroscienze

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Quantificazione del comportamento del grooming di Drosophila

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Analisi quantitativa di un neurone Arborization dentritico complessità in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...