이 프로토콜에 설명된 실험 장비의 일부에 대한 액세스를 제공한 Instituto Gulbenkian de Ciência (IGC)에 감사드립니다. 이 작품은 포르투갈 과학기술재단(FCT), 리스보아-01-0145-FEDER-007660에 의해 지원되었다. PTDC/NEU-NMC/2459/2014, IF/00697/2014, 라 카이사 HR17-00595 ~ PMD, 호주 연구위원회 미래 펠로우십(FT170100259)이 CKM에 있습니다.

1. 자당 효모 (SY) 다이어트의 준비
<ol><li>다량 영양소 균형과 L3 양육 다이어트에 대한 모든 건조 성분 (한천, 효모, 자당)의 무게. 1L의 식품을 준비하는 데 필요한 각 성분에 대한 그램의 양은 도 1B로표시됩니다. 참고: 60mm 페트리 접시를 채우기 위해서는 약 13mL의 음식이 필요하다는 점을 고려하십시오.</li>
	<li>모든 성분을 멸균 증류수(식품 준비에 필요한 총 물량의 약 50%를 사용)에 녹여 5-10분 동안 배지를 저어줍니다.</li>
	<li>50 분 동안 자동 클라브.</li>
	<li>매체가 식히는 것을 허용한 후에, 규정식에 니파진 과 선전 산 용액을, 3%와 0.3%의 최종 농도 (v/v)에 각각 추가하십시오. 다량 영양소 균형 식단에 1 %의 최종 농도 (v /v)에 파란색 식품 염료를 추가하십시오. 증류수로 총 볼륨을 완성합니다.</li>
	<li>60mm 페트리 접시에 음식 식단을 조심스럽게 붓기 때문에 부어 넣은 음식의 양은 각 접시에 거의 동일합니다. 식단의 P:C 비율로 접시에 라벨을 붙입니다. 참고: 수유 분석 당일 다량 영양소 균형 식단을 준비합니다. 가능하지 않은 경우, 준비된 식단을 밀봉 된 용기에 4 °C에서 최대 3 일 동안 보관하십시오. 저장 기간이 길수록 식단이 너무 건조하고 단단하게 변하며 애벌레는 배지에 잠복할 수 없습니다.</li>
</ol>2. 부모의 라인의 유전 십자가
참고: Gal4/UAS시스템(21)을 사용하여 유전적 십자가를 설정합니다. 본 프로토콜에서, 특정 신경 인구에서 신경 기능을 활성화하기 위해, UAS dTRPA1 선17의 여성 처녀가 사용되고 Janelia Gal4 라인(그림 2A)에서남성에게 교차하였다. 사용된 유전 제어는 dTRPA1 선과 루빈 Gal4 수집을 생성하는 데 사용되는 벡터에 Gal4를 운반하는 "빈 GAL4" 라인 사이의 십자가의 자손이지만 규제 조각이 존재하지 않는 (attP2)22. 신경 억제를 촉진하기 위해, DTRPA1 대신 ShibireTS20을 인코딩하는 UAS 라인을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>L3 양육 다이어트 플레이트와 함께 60mm 배아 수집 케이지를 설치하고 활성 효모 페이스트를 보충합니다.</li>
	<li>성인 UAS dTRPA1 여성 처녀와 Janelia Gal4 남성, 5-8 일 세, 배아 수집 케이지에 24-48 h, 25 °C에서, 60 % 습도 와 12:12 밝은 어두운 주기(그림 2A). 60mm 배아 수집 케이지의 경우, 약 100 처녀 암컷과 십자가 당 30 남성을 사용합니다.</li>
	<li>짝짓기 기간이 끝나면 유전 적 십자가에 사용되는 L3 양육 다이어트 플레이트를 제거하고 폐기하십시오. 계란 평지와 애벌레 준비를 수행하기 위해 신선한 L3 양육 다이어트 플레이트를 대체합니다.</li>
</ol>3. 제3성 애벌레준비 (L3)
<ol><li>짝짓기 성인 파리를 신선한 L3 양육 다이어트 플레이트로 옮기고 25°C(도2B)에서3-4h동안 계란 누워가 발생할 수 있도록 한다. 모든 플레이트가 유전자형, P:C 비율의 식이요법과 달걀 누워서 표시되어 있는지 확인하십시오. 참고: 시간을 절약하려면 계란을 추가로 취급하지 않는 L3 양육 식단에 직접 계란 을 놓습니다. 소규모 유전 적 스크리닝의 경우 사과 주스 천판을 사용하여 계란 누워의 최적화를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>계란 누워 기간의 끝에서, 케이지에서 접시를 제거하고 플라스틱 뚜껑으로 덮습니다. 효모 추출물이 L3 양육 판을 보충하는 데 사용되는 경우, 계란 누워의 끝에 있는 모든 잔류 효모를 제거하십시오. 이것은 애벌레 성장 도중 비 균일한 공급을 피하기 위하여 중요합니다. 참고 : 짝짓기 성인은 신선한 L3 양육 다이어트 플레이트로 옮길 수 있으므로 더 많은 계란 낳기를 수행하고 더 많은 실험적 애벌레를 얻을 수 있습니다. 연속 계란 평신도는 한 주 동안 같은 성인과 함께 수행 할 수 있습니다.</li>
	<li>접시당 계란 수를 추정하고 접시 당 최대 200 배아에 애벌레 밀도를 유지합니다. 이 추정은 플레이트의 1 분기에 있는 배아의 수를 계산하여 행해질 수 있습니다. 참고: 과밀한 접시는 애벌레 발달을 지연시키고 애벌레 먹이 주기 행동에 영향을 미칩니다.</li>
	<li>L3 양육 플레이트를 18°C(허용 온도), 60% 습도 및 12:12 광어두운 사이클로 배양하고 유충이 9일 동안 성장할 수 있도록합니다(그림 2B).</li>
	<li>계란 누워 후 9 일째에 (AEL), 각 유전자형에서 10 L3의 세 그룹을 수집 (및 복제에 대한) 테스트할 수 있습니다. 또한 "제로 염료 식품"제어를 위해 10 L3그룹을 수집합니다. 애벌레 수집은 계란 누워를 수행하는 데 사용되는 하루의 동등한 기간 동안 수행되도록 (예를 들어, 계란 누워가 오전 10시에서 오후 2시 사이에 발생하는 경우, 같은 기간 동안 애벌레를 수집 9 일 AEL) 가능한 한 부드럽게 수행, 포셉 #5 또는 페더급 포셉을 사용하여. 다음 단계(3.6)에 표시된 대로 애벌레를 직접 이송합니다. 참고 : "제로 염료 식품"제어 동물은 먹이 분석에서 청색 염료없이 음식을 제공하는 애벌레입니다. 이 제어는 th 애벌레 추출물의 배경 흡광도를 제거하는 것이 필수적입니다.</li>
	<li>수집된 실험유충을 1mL의 물을 포함하는 플라스틱 접시 무게 보트로 옮는다. 그림 3에주어진 방향을 따라 L3가 아니라 L2가 아닌 수집되는지 확인합니다. 참고: L3를 물 또는 1x 인산염 완충식식염(PBS)이 함유한 플라스틱 보트에 대한 컬렉션은 먹이 주기 분석이 시작되기 전에 유충을 잘 수분을 유지하는 것이 중요합니다. 이것은 다른 유전자형에서 몇몇 실험 L3 단이 동시에 집합되는 경우에 특히 중요합니다. 각 그룹에 대한 수집 순서를 추적하므로 각 그룹에 대한 음식 박탈 기간의 차이는 최소화됩니다. 이 단계에서 플라스틱 보트를 사용하면 애벌레가 수조에 직접 떠들어갈 수 있으므로 4.3 단계의 선택적 단계를 용이하게합니다.</li>
</ol>4. 열유전학 활성화 및 선택없는 수유 분석
참고: circadian 리듬과 관련된 가능한 변화를 최소화하기 위해 하루 중 거의 같은 시간에 수유 방법을 수행하는 것이 좋습니다. 또한 항상 제어 실험("빈 Gal4" 선의 자손은 UAS dTRPA1 및 "제로 염료 식품" 애벌레로 넘어간)을 관심 있는 유전자형과 병행하여 실행합니다.
<ol><li>인큐베이터를 30°C(비허용 온도)로 설정하고 높은 수준의 습도(최소 65%)를 유지합니다. 분석 중에 유충 탈수를 피하십시오.</li>
	<li>수유 분석서를 시작하기 전에 30°C에서 30분 동안 따뜻하게 하여 분석 플레이트의 온도를 상량화합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 37° C 수조에서 2분 동안 실험유충을 열쇼크. 일부 물을 포함하는 플라스틱 무게 보트에서 동물과 함께이 단계를 수행합니다. 참고: 이 단계의 목적은 수유 분석의 시작부터 뉴런의 발사를 촉진하여 뉴런 활성화를 강화하는 것입니다.</li>
	<li>1h 준비된 여러 타이머를 설정합니다. 사용할 타이머수는 테스트 중인 실험 그룹의 수와 애벌레 처리에 대한 실험자의 숙련도 수준에 따라 달라집니다. 참고: 여러 타이머의 사용은 모든 유전자형에 대해 분석 의 지속 시간을 일관되게 유지하는 데 중요합니다.</li>
	<li>플라스틱 보트에서 물을 조심스럽게 배출하고, 촉촉한 부드러운 브러시를 사용하여, 부드럽게 분석 판의 중심으로 보트에서 L3 그룹을 전송합니다. 플레이트의 뚜껑을 뒤로 하고 정확한 1h 급식 세션을 유지하기 위해 각 플레이트(또는 플레이트 그룹)에 대한 타이머를 시작합니다.</li>
	<li>애벌레가 30°C에서 1시간 동안 먹이를 주도록 허용한다(도2C). 참고: 어둠 속에서 분석의 성능다이어트는 같은 염료 농도를 포함 하더라도 톤이 다를 것이기 때문에 식단 전반에 걸친 시각적 단서의 차이를 제어하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>접시를 얼음 욕조로 옮기면 먹이 주기 분석서를 중지하십시오. 가능한 한 얼음을 눌러 플레이트에 안정적인 표면을 제공합니다. 참고: 추운 온도는 잠복 및 굴착 행동을 억제하여 수유의 끝을 촉진합니다. 애벌레의 대부분은 몇 분 후에 음식 접시를 표면화하고 다음 단계에서 회복을 촉진합니다.</li>
</ol>5. 식품 염료 추출
<ol><li>테스트된 10L3의 각 그룹에 대해 2mL 마이크로튜브를 준비하여 약 0.5mm 유리 구슬(마이크로튜브의 바닥 부분을 채우기에 충분함)과 300 μL의 얼음-차가운 메탄올을 함유하고 있습니다. 벤치 쿨러를 사용하여 마이크로 튜브를 추위에 유지합니다. 주의: 메탄올은 인화성이 높고 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 지역에서 작업하고 니트릴 장갑을 착용하는 등 이 시약을 처리하는 데 권장되는 모든 안전 절차를 따르십시오. 참고: 메탄올의 사용은 애벌레 샘플을 고치고 큐티클에서 멜라늄화 반응을 피하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>#5 또는 페더급 집게를 사용하여, 조심스럽게 먹이 분석 플레이트에서 10 L3의 그룹을 복구하고 일부 물을 포함하는 분석 판의 뚜껑으로 전송. 유충을 헹구고 몸에 있는 음식 파편을 제거하면서 유충을 부드럽게 다루어 부상을 피하십시오. 복제당 각 유전자형에 대해 회수된 애벌레의 수에 대한 기록을 보관하여 애벌레당 평균 양의 음식 섭취량을 정량화할 수 있도록 하십시오. 참고 : 부상당한 애벌레는 피부색을 혼합하여 착색 정량화에 적합하지 않을 수 있기 때문에 버려야합니다.</li>
	<li>L3 그룹을 5.1로 제조된 2mL 마이크로튜브로 전송합니다.</li>
	<li>애벌레 조직을 lyse하여 5.1 단계에서 첨가된 조직 용액 및 유리 구슬을 사용하여 기계적 용해 방법에 의해 용기에서 식품 염료를 추출합니다. (티슈 라이저를 사용할 수 없는 경우 균질화 유봉을 사용하십시오). 우선, 4 °C(도 2D)에서이단계를 수행합니다. 참고: 이 단계의 지속 시간은 사용되는 장비에 따라 달라집니다. 종래의 조직 용액을 사용하여 1 분 추출이 충분합니다. 시간 수축의 경우 프로토콜은 이 단계가 끝날 때 일시 중지되고 나중에 진행할 수 있습니다. 샘플을 -20°C에 저장합니다.</li>
	<li>추출물을 1.5mL 마이크로튜브를 청소하여 새로운 1.5mL 마이크로튜브에 직접 2mL 마이크로튜브를 반전시음으로써 이송한다. 부드럽게 수행하면 대부분의 유리 구슬은 2 mL 마이크로 튜브의 하단에 유지됩니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 최대 속도로 추출물을 원심분리하여 세포 이물질을 치웁울 수 있습니다.</li>
	<li>1.5 mL 마이크로튜브를 청소하기 위해 초월제를 수집합니다. 셀룰러 파편이 초월제에서 여전히 보이는 경우 5.6 및 5.7 단계를 반복하십시오.</li>
</ol>6. 식품 소비의 색채 정량화
<ol><li>시작 블루 염료 용액의 메탄올에서 직렬 1:2 희석을 수행하여 교정 곡선을 생성하기 위해 표준 솔루션을 준비합니다. 빈 으로 메탄올만 사용하십시오. 표준의 농도는 동물의 음식 섭취량 수준에 따라 달라집니다. 참고: 여기에 제시된 파일럿 스크린의 경우, 애벌레 추출물에 대해 얻어진 염료 농도가 0.02에서 1.93 μL/mL/ mL범위로, 메탄올내 2 μL/mL 청색염 용액의 8개의 직렬 희석의 흡광도를 측정하여 얻어진 표준 곡선을 사용하였다. 필요한 경우 실험 용료의 염료 농도에 따라 이러한 용액의 농도를 증가또는 감소시합니다.</li>
	<li>실험용 시료(5.7단계에서 얻어진) 100μL을 96웰 마이크로플레이트의 우물로 이송하고 플레이트 판독기(도2E)를이용하여 600nm에서 흡광도를 측정한다. 배경 흡광도를 제거하려면 애벌레 추출물("제로 염료 식품 제어)에 대한 "제로"로 청색 염료없이 식품에 공급된 애벌레에서 얻은 추출물의 흡광도를 측정합니다.</li>
	<li>표준 곡선을 생성하고 각 실험 애벌레 그룹에서 샘플에 대해 얻은 흡수도 값을 음식 섭취량의 양(mL의 부피)과 상관관계를 맺습니다. 5.2 단계에서 각 그룹에 대해 수집된 애벌레수를 고려하여 애벌레당 평균 음식 소비량 찾기</li>
</ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ol1mpiad:+concordance+of+behavioural+faculties+of+stage+1+and+stage+3+Drosophila+larvae.">The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+larvae+make+nutritional+choices+that+minimize+developmental+time.">Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time.</a> Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).</li><li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+food+intake+in+Drosophila.">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+foraging+and+social+behavior+by+the+Drosophila+neuropeptide+Y-like+system.">Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system.</a> Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).</li><li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila.">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li><li>Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-regulation+of+cold-resistant+food+acquisition+by+insulin-+and+neuropeptide+Y-like+systems+in+Drosophila+melanogaster.">Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster.</a> Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).</li></ol>

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이 프로토콜을 사용하면 특정 신경 인구의 열유전학 활성화하에서 유충의 능력을 테스트하여 단백질과 탄수화물의 섭취 수준을 조절할 수 있으며, 두 가지 주요 다량 영양소가 다른 P:C 조성물의 식단에 노출될 수 있습니다. 이 방법은 다른 다량 영양소 품질의 다이어트에 걸쳐 음식 섭취량의 제어와 관련된 신경 인구를 식별하는 것을 목표로 애벌레 예비 검진의 맥락에서 테스트되었다. 이 작품?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.
Figure 1&#160;was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.

Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

모든 동물은 생존, 성장 및번식을위해 필요한 양의 영양소를 얻기 위해 균형 잡힌 식단에 의존합니다. 무엇을 얼마나 먹을지의 선택은 포만 수준과 같은 동물의 내부 상태와 관련된 다양한 상호 작용 요인및 식품 품질2,3,4,5와같은 환경 조건에 의해 영향을 받습니다. 단백질과 탄수화물은 두 가지 주요 다량 영양소이며 균형 잡힌 섭취는 동물의 생리적 과정을 유지하는 데 필수적입니다. 따라서, 먹이 행동을 통제하고 이러한 다량 영양소의 균형 잡힌 섭취를 유지하는 신경 메커니즘의 이해는 매우 관련이 있다. 이는 수명, 대변, 대사 건강 과 같은 생명력 특성이단백질 섭취량6,7,8,9,10의수준에 직접적으로 영향을 받고 있기 때문이다.
포유류를 포함한 복잡한 동물과 함께 진화적으로 보존된 먹이 습관을 나타내는 더 간단한 더 많은 기관 유기체의 사용은 이러한 유형의 연구에 필수적입니다. 중요한 것은, 이러한 간단한 동물 모델은 비용이 많이 드는, 윤리적, 기술적으로 더 효과적인 맥락에서 복잡한 생물학적 질문을 해부 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. 지난 수십 년 동안, Drosophila는강력한 유전 도구 키트, 복잡하고 고정관적인 행동 및 포유류와 말초 및 영양 감지 메커니즘의 보존 된 아키텍처를 통해 행동 신경 생물학자11을위한유익한 모델이되었습니다. 궁극적으로, 희망은 음식 섭취가 이 동물에서 어떻게 규제되는지 이해함으로써, 더 간단한 신경계로, 우리는 인간 섭식 장애의 근본적인 신경 오작동을 풀어 놓기 시작할 수 있다는 것입니다.
먹이 행동에 대 한 신경 기판의 연구는 그들의 신경 활동을 조작 하는 동안 동시에 동물의 음식 섭취를 측정 할 수 있는에 깊이 의존. 섭취하는 음식의 최소한의 양으로 인해 파리가 먹는 음식의 양을 정량화하는 것은 매우 어렵고 현재 사용 가능한 모든 방법은 상당한 한계를 제시합니다. 따라서, 금본위제는 상호 보완적인방법론(12)의조합을 사용하는 것입니다. 성인 파리는 역사적으로 유전 및 행동 모델로 선호되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, Drosophila 애벌레, 또한 먹이 행동을 코딩 하는 신경 기판을 조사 하는 기회를 제공. 약 12,000개의 뉴런을 가진 애벌레 중추 신경계 (CNS)는 대략 150,000개의 뉴런을 포함하는 성인의 그것 보다는 현저하게 더 적게 복잡합니다. 이 낮은 복잡성은 수치뿐만 아니라 기능적입니다, 유라 행동은 간단한 기관차 기능과 감각 시스템에 의존하기 때문에. 그들의 신경계의 명백한 단순성에도 불구하고, 애벌레는 아직도 완전한 먹이 행동을 전시하고, Drosophila 애벌레에 있는 음식 섭취를 정량화하는 몇몇 방법은5,13,14,15를기술되었습니다. 신경 활동의 조작과 짝을 이면, Drosophila 애벌레는 음식 섭취의 신경 조절을 이해하기 위한 고도의 기관모형을 구성할 수 있습니다.
여기에 제공 된 다른 다량 영양소 품질의 다이어트에 노출 된 애벌레의 음식 섭취량을 정량화하는 상세한 프로토콜이 있습니다. 이른바 다량영양소 균형 식단은 단백질과 탄수화물 함량이 다르며, 특히 탄수화물(P:C) 비율에 대한 단백질과 관련하여 1:1(단백질이 풍부한 식단), 1:4(중간 식단), 1:16(단백질 가난한 식단)에 대해 도 1A에나타낸 바와 같이. 간단히 말해서, 청색 식품 염료로 염색한 이 3개의 동종 자당 효모(SY)를 사용하여 정량적 무선택 수유 분석이 설립되었습니다. 효모 추출물과 자당은 단백질 및 탄수화물 공급원으로 사용되었고, 둘 다 탄수화물을 함유하고 있기 때문에, P:C 비율의 변이는 이전에 설명된 바와 같이, 이 두 성분의 균형을 변경하여 얻어졌다16 및 도 1B에나타난 바와 같이. 주요 실험 단계를 보여주는 프로토콜의 회로도 개요는 그림 2에서사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 다른 P:C 비율의 규정식에 있는 애벌레 공급 수준의 규칙에 특정 신경 인구의 역할을 조사하고 열유전학 신경 스크린의 맥락에서 설치되었습니다. 잘 특징적인 신경유전학 적 도구는 과도 수용체 전위 (TRP) 제품군에서 사용되었다: 드로소필라 과도 수용체 잠재적 채널 (dTRPA1), 이는 온도 및 전압 게이트 양이온 채널입니다, 주변 온도가 25 ° C17이상 상승 할 때 행동 잠재력의 발사를 허용. dTRPA1 트랜스진을 표현하기 위해, 우리는 Janelia 연구 캠퍼스18,19에서플라이 라이트 프로젝트의 맥락에서 루빈 실험실에 설립 된 드로소필라 게놈에서 시스- 규제 영역을 기반으로 Gal4 라인을 이용했다.
여기서 설명된 프로토콜은 활성화 화면의 맥락에서 확립되었지만, dTRPA1의 대안으로, 온도에 민감한 뉴런 소음기 ShibireTS20을사용하여 억제 스크린을 수행하기 위해, 즉 다른 특정 요구 또는 관심사에 실험자가 쉽게 적응할 수 있다. 이 및 기타 적응은 프로토콜 및 토론 섹션에서 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2112px;" width="2113">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">1.5 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.690.001</td>
			<td style="width:1272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10xPBS</td>
			<td style="width:271px;">Nytech</td>
			<td style="width:247px;">MB18201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.0 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.695.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Greiner Bio-one, Austria</td>
			<td style="width:247px;">628161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">96 well microplates</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-204453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Bench cooler</td>
			<td style="width:271px;">Nalgene, USA</td>
			<td style="width:247px;">Labtop Cooler 5115-0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Blue food dye</td>
			<td style="width:271px;">Rayner, Billingshurst, UK</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Cell disruption media</td>
			<td style="width:271px;">Scientific Industries, Inc.</td>
			<td style="width:247px;">888-850-6208</td>
			<td>(0.5 mm glass beads)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Dish weight boats</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-201606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Embryo collection cage for 60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td style="width:247px;">FLY1212 (59-100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight forceps</td>
			<td style="width:271px;">BioQuip Products, USA</td>
			<td style="width:247px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fly food for stocks maintenance</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Forceps #5</td>
			<td style="width:271px;">Dumont</td>
			<td style="width:247px;">0108-5-PS</td>
			<td>Standard tips, INOX, 11cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">LMS Ltd, UK</td>
			<td style="width:247px;">Series 2, Model 230</td>
			<td>For thermogenetic feeding assay (30&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">Percival Scientific, USA</td>
			<td style="width:247px;">DR36NL</td>
			<td>To stage larvae (19&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Janelia lines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Detailed information in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Macronutrient balancing diets</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Methanol</td>
			<td style="width:271px;">VWR</td>
			<td style="width:247px;">CAS number: 67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:271px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:247px;">H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nitrile gloves</td>
			<td style="width:271px;">VWR, USA</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:271px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:247px;">5804 R / Serial number: 5805CI364293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Rubin Gal4 ines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ShibireTS UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 66600</td>
			<td>Provided by Carlos Ribeiro Group</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Soft brushes</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>For sorting anaesthetised fruit flies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Spectrophotometer plate reader</td>
			<td style="width:271px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:247px;">Multiskan Go 51119300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:271px;">Nikon</td>
			<td style="width:247px;">1016625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sucrose</td>
			<td style="width:271px;">Sidul, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Third-instar larvae (L3) rearing diet</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Timer</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tissue lyzer / bead beater</td>
			<td style="width:271px;">MP Biomedicals, USA</td>
			<td style="width:247px;">FastPrep-24 6004500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">TRPA1 UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 26264</td>
			<td>Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 &#8728;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Water bath</td>
			<td style="width:271px;">Sheldon Manufacturing Inc., USA</td>
			<td style="width:247px;">W20M-2 / 03068308 / 9021195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>51% Protein, 15% Carbohydrate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of macronutrients intake in a thermogenetic neuronal screen using drosophila larvae

먹이를 주고 먹이를 주는 행동을 통해 동물은 개발, 건강 및 피트니스에 필수적인 에너지와 영양소의 원천에 접근할 수 있습니다. 이러한 행동의 신경 조절을 조사하는 것은 영양 항상성의 근본적인 생리적 및 분자 메커니즘의 이해를 위해 필수적입니다. 벌레, 파리 및 물고기와 같은 유전적 인 동물 모델의 사용은 이러한 유형의 연구를 크게 용이하게합니다. 지난 10 년 동안, 과일 플라이 Drosophila 멜라노가스터는 먹이와 위조 행동의 신경 제어를 조사하는 신경 생물학자에 의해 강력한 동물 모델로 사용되었습니다. 의심 할 여지없이 가치가 있지만, 대부분의 연구는 성인 파리를 검사합니다. 여기서, 우리는 애벌레가 그들의 단백질과 탄수화물 함량이 다른 규정식에 드러날 때 먹이 행동을 통제하는 신경 기질을 조사하기 위하여 간단한 애벌레 신경계를 이용하는 프로토콜을 기술합니다. 우리의 방법은 뉴런 열유전학 활성화 스크린의 맥락에서 수행되는 정량적 색색 무선택 공급 분석법을 기반으로 합니다. 판독으로, 1 시간 간격을 통해 애벌레에 의해 먹는 음식의 양은 탄수화물 (P:C) 비율에 그들의 단백질에서 다른 3개의 염료 표지 규정식 의 한에 드러낼 때 이용되었습니다. 이 프로토콜의 효능은 다른 다량 영양소 품질의 식단에서 먹는 음식의 양을 조절하는 후보 신경 인구를 식별함으로써, 애벌레 Drosophila에서신경 유전학 화면의 맥락에서 입증된다. 우리는 또한 표현형으로 시험된 유전자형을 분류하고 그룹화할 수 있었습니다. 문헌에서 현재 사용 가능한 방법에 대한 간략한 검토 외에도 이러한 방법의 장점과 제한 사항이 논의되고 이 프로토콜이 다른 특정 실험에 어떻게 적응할 수 있는지에 대한 몇 가지 제안이 제공됩니다.

Drosophila 애벌레는 과잉 탄수화물을 섭취하는 비용으로 단백질 섭취량을 조절23 (그림 2E의회로도 플롯). 실제로, 단백질 섭취량의 이러한 우선 순위는 다른 많은 동물에서 관찰되었으며24,25를활용하는 단백질이라고 불린다.
이 강력한 먹이 행동 반응을 활용, 행동 기반 화면 다량 영양?...

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Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

여기에 설명된 프로토콜은 다른 다량 영양소 품질의 식단에 노출된 Drosophila 멜라노가스터 애벌레에 의해 정의된 시간 간격 내에 섭취되는 음식의 양을 정량화할 수 있도록 하는 프로토콜이다. 이 소는 신경 열유전학 스크린의 맥락에서 행해질 것입니다.

드로소필라 애벌레를 사용하여 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취의 정량화

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

3.6K 조회수.  Monash University. 여기에 설명된 프로토콜은 다른 다량 영양소 품질의 식단에 노출된 Drosophila 멜라노가스터 애벌레에 의해 정의된 시간 간격 내에 섭취되는 음식의 양을 정량화할 수 있도록 하는 프로토콜이다. 이 소는 신경 열유전학 스크린의 맥락에서 행해질 것입니다.

비디오: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

를 사용하여 화합물 Bioactivity위한 이점 Nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

연구

신경과학

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

에 Appetitive 연관 강한 학습<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

모세관 공급 분석은 식품 섭취를 측정<em&gt; 노랑 초파리</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Drosophila 그루밍 행동의 부량

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

콜드 통각에 대한 소설 분석<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...