L’apport sanguin normal à la cochlée est d’une importance cruciale pour la maladie de Ménière, en particulier pour maintenir le potentiel cochléaire intérieur qui est la force motrice essentielle pour la transaction des cellules ciliées. Cette fonction de la circulation sanguine a été étroitement associée à différentes formes de perte auditive. Une meilleure compréhension du flux sanguin cochléaire permettra une prise en charge plus efficace des troubles auditifs résultant d’un dysfonctionnement du flux sanguin.
Cependant, la mesure directe du débit sanguin est très très difficile en raison de la difficulté à évaluer l’oreille interne. Les techniques d’évaluation du débit sanguin cochléaire sont actuellement en cours de développement. Ici, nous démontrons l’une des méthodes récentes établies dans notre laboratoire fenêtre musculaire ouverte en accommodation avec un microscope à fluorescence à haute résolution pour réduire le flux sanguin cochléaire chez les petites espèces animales telles que la souris.
L’application de cette technique avec des modèles de masse transgénétiques a le potentiel de faire progresser la recherche pour démêler les liens entre la fonction auditive et la pathologie liée au flux sanguin cochléaire dans le risque intravasculaire. Nos procédures doivent être menées avec prudence. En plus de l’hémorragie corporelle momentanée, les signes vitaux de l’animal, y compris la pression artérielle et le rythme cardiaque, doivent être surveillés pendant votre chirurgie.
Commencez par recueillir environ un millimètre de sang dans l’héparine par ponction cardiaque. Centrifuger le sang à 3000 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Retirer le plasma, puis laver la pastille de cellules sanguines avec un millilitre de PBS trois fois par centrifugation à 3000 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.
Marquez les cellules sanguines avec un millilitre de 20 micromolaires DiO ou Dil dans du PBS et incuber dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez les cellules sanguines marquées avec un millilitre de PBS et centrifugez trois fois à 3000 fois G pendant trois minutes. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 30% d’hématocrite avec environ 0,9 millilitre de PBS avant l’injection.
Préparez des instruments chirurgicaux stériles et une plate-forme d’imagerie et placez un coussin chauffant sous le rideau. Surveillez le mauvais réflexe et le tonus musculaire général des souris anesthésiées pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Placez l’animal sur le coussin chauffant chaud et sa queue dans le système de surveillance pour surveiller la pression artérielle et le rythme cardiaque.
Maintenez la température rectale à 37 degrés Celsius et notez la pression artérielle systolique, la pression artérielle diastolique et la pression artérielle moyenne de l’animal dans l’état anesthésié. Ouvrez la bulle tympanique gauche par une approche latérale et ventrale au microscope en laissant la membrane tympanique et les osselets intacts. Faites une incision le long de la ligne médiane du cou de l’animal avec sa tête immobilisée pour minimiser les mouvements.
Retirer la glande sous-mandibulaire gauche et le ventre postérieur du muscle digastrique et cautériser. Localisez et exposez la bulle osseuse en identifiant le muscle sternocléidomastoïdien et le nerf facial s’étendant antérieurement vers la bulle. Ouvrez la bulle osseuse avec une aiguille de calibre 30 et retirez soigneusement l’os environnant avec une pince chirurgicale pour fournir une vue claire de l’artère cochléaire et stapédienne avec sa marge médiale située sur le bord de la niche de la fenêtre ronde et provoquant une supériorité antérieure vers la fenêtre ovale.
Utilisez une petite lame de couteau pour gratter l’os de la paroi latérale au milieu du sommet de la cochlée de la souris à environ 1,25 millimètre de l’apex jusqu’à ce qu’une fine tache soit fissurée. Retirez les copeaux d’os avec de petits crochets métalliques. Couvrir la fenêtre du récipient avec un glissement de couvercle coupé pour préserver les conditions physiologiques normales et fournir une vue optique pour l’enregistrement des images du navire.
Faites une incision d’un centimètre le long de la veine saphène droite pour exposer le vaisseau. Infuser successivement 100 microlitres chacun de la solution FITC-Dextran et de la suspension de cellules sanguines dans l’animal à travers la veine saphène pour permettre la visualisation des vaisseaux sanguins et le suivi du flux sanguin. Observez le flux sanguin en temps réel sur un moniteur vidéo cinq minutes après l’injection.
Imagez les vaisseaux sanguins à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un objectif à longue distance de travail et d’un boîtier de lampe contenant un filtre d’excitation à bandes multiples et un filtre d’émission compatible. Enregistrez la vidéo à l’aide d’une caméra numérique haute résolution en noir et blanc couplée à une charge acquérant plus de 350 images par vidéo. Assurer une analyse réussie de la vitesse d’écoulement.
Mesurez le diamètre du navire à l’aide d’un logiciel approprié et déterminez la distance entre deux points fixes à travers le navire dans les images acquises. Ouvrez la vidéo du flux sanguin dans le logiciel et définissez l’échelle des images. Suivez les cellules sanguines colorées DiO sélectionnées à l’aide de la fonction de suivi.
Utilisez ensuite la distance parcourue par les cellules et l’intervalle de temps entre les images de la vidéo pour calculer automatiquement la vitesse d’écoulement. Calculez le débit volumétrique à l’aide de l’équation donnée dans le manuscrit du texte. Pour créer le modèle d’exposition au bruit avant l’enregistrement du flux sanguin, placez les animaux dans des cages en treillis métallique et exposez-les à un bruit à large bande à un niveau de pression acoustique de 120 décibels dans une cabine d’exposition au bruit pendant trois heures.
Puis pour trois heures supplémentaires le lendemain. Enregistrez le débit sanguin deux semaines après l’exposition au bruit. Après exposition chirurgicale des capillaires cochléaires dans la paroi latérale, l’observation microscopique par fluorescence intravitale à haute résolution des cellules sanguines marquées DiL dans les vaisseaux marqués FITC Dextran a été réalisée à travers une fenêtre de vaisseau ouverte.
Les cellules sanguines marquées DiL dans les vaisseaux Stria marqués avec FITC Dextran sont montrées ici. Les cellules sanguines marquées par Dio marquées avec FITC Dextran montrent que la densité des vaisseaux du ligament spiralé est plus clairsemée que celle du Stria vascularis, plus dense. La MIV haute résolution montre les schémas de flux sanguin dans les groupes témoins et exposés au bruit.
Le schéma perturbé de la circulation sanguine peut être vu dans les groupes exposés au bruit. Les anomalies comprenaient une réduction du diamètre du navire et une variation accrue du diamètre du navire. Les vitesses de flux sanguin dans les groupes témoins et exposés au bruit ont été calculées en suivant les racines des cellules sanguines marquées DiO.
La vitesse et le volume sanguins dans le groupe exposé au bruit étaient significativement inférieurs à ceux du groupe témoin. La mise en place réussie de la fenêtre du vaisseau ouvert nécessite un haut degré de compétence chirurgicale. Des précautions doivent être prises lors de l’enlèvement de l’os de la paroi latérale cochléaire.
