Ces travaux ont été soutenus par Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 à Toshihide Kurihara et 20K18393 à Yukihiro Miwa) du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie (MEXT).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Keio University School of Medicine.
1. Préparation d’instruments chirurgicaux et d’animaux
<ol><li>Autoclavez les instruments chirurgicaux et gardez-les dans 70% d’alcool éthylique. Avant chaque nouvelle intervention chirurgicale, nettoyez soigneusement les instruments chirurgicaux en utilisant 70 % d’alcool éthylique.</li>
	<li>Préparer les souris BALB/cAJc1 mâles (6 semaines, 26-28 kg) dans une pièce exempte d’agents pathogènes spécifiques (FPS) afin de maintenir des conditions stériles avant, pendant et après la chirurgie.</li>
</ol>2. Occlusion commune transitoire d’artère carotide commune (tBCCAO)
<ol><li>Mettez une souris sous anesthésie par injection intraperitoneal avec une combinaison de midazolam (40 μg/100 μL), de médetomidine (7,5 μg/100 μL) et de tartrate de butorphanol (50 μg/100 μL), appelé « MMB », commedécrit précédemment 8,9. Tenez les peaux arrière de la souris pour empêcher la souris de se cogner les yeux jusqu’à ce que la souris soit complètement anesthésiée.<ol>
<li>Jugez la profondeur de l’anesthésie en pinçant l’ateil de la souris jusqu’à ce qu’il n’ait pas de réponse, dont la méthode est couramment utilisée pour vérifier l’anesthésiecomplète 10. REMARQUE : En général, moins de 5 minutes sont nécessaires pour que les souris s’endorment. Les recettes appropriées pour l’anesthésie générale peuvent être différentes selon les institutions.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Appliquer une goutte de 0,1% purifié sodium hyaluronate solution goutte oculaire aux yeux pour prévenir la sécheresse sur les yeux sous anesthésie.</li>
	<li>Placez la souris sur son dos et fixez les pattes de la souris à l’aide de rubans adhésifs.</li>
	<li>Désinfecter la zone du cou de la souris à l’aide de 70% d’alcool éthylique avant la chirurgie. REMARQUE : La coupure addition supplémentaire de la fourrure n’a pas été exécutée car ceci peut causer l’inflammation suivantede peau 11,12.</li>
	<li>Effectuez une incision sagittale du cou à l’l’insu d’unelame ( figure 1). REMARQUE : L’incision doit être faite sur la ligne médiane entre le cou, le sternum et la trachée.</li>
	<li>Séparez soigneusement les deux glandes salivaires à l’aide de deux forceps et mobilisez-les pour visualiser les AC sous-jacents.</li>
	<li>Isolez soigneusement le CCA droit des nerfs vagal respectifs et des veines qui l’accompagnent sans nuire à leurs structures, et placez deux sutures de soie 6-0 sous le CCA. Attachez les deux liens étroitement pour bloquer le flux sanguin (Figure 1). REMARQUE : Pendant l’intervention, de petites veines pourraient être endommagées. Si des saignements sont observés, l’essuyage est nécessaire pour visualiser clairement les AC.</li>
	<li>Trouvez soigneusement le CCA gauche des nerfs vagal respectifs et des veines qui l’accompagnent sans nuire à leurs structures, et occlusez le CCA gauche pendant 2 secondes par une pince (figure 1). REMARQUE : Une aiguille de suture en soie 6-0 doit être placée sous le CCA gauche pour marquer un emplacement pour le serrage.</li>
	<li>Après la réouverture du CCA gauche, suture des plaies du cou par une suture de soie 6-0 et appliquer une touche d’antibiotique (50 μL) sur le cou pour inhiber l’infection bactérienne. REMARQUE : Retirez doucement une pince pour éviter d’endommager le mur artélial lors de la réouverture du CCA gauche.</li>
	<li>Injectez 0,75 mg/kg d’hydrochlorure d’atipamezole intraperitoneally à la souris pour aider la souris récupérée de l’anesthésie profonde rapidement. Remettre la souris dans une cage à souris avec des coussinets préchauffés. REMARQUE : Ne laissez pas la souris laissée sans surveillance jusqu’à ce que la souris reprenne suffisamment conscience pour maintenir la récumbence sternale.</li>
	<li>Injecter 0,4 mg/kg de tartrate de butorphanol à la souris pour la gestion de la douleur lorsque la souris se réveille. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Comme premier indice pour réussir tBCCAO, la paupière tombant de la souris peut être observée (Figure 2).</li>
	<li>Pour l’euthanasie, injecter 3x de mélange MMB aux souris et les sacrifier pour des expériences.</li>
</ol>3. Observations générales (taux de survie et tombant des paupières)
<ol><li>Après la chirurgie, vérifiez les taux de survie pour toutes les causes de décès au jour 0 (après la chirurgie), 1, 3 et 7.</li>
	<li>Évaluer la limidation par une échelle de notation de 4 points : 1 = pas de tombant, 2 = tombant léger (~50%), 3 = tombant sévère (plus de 50%), et 4 = tombant sévère avec décharge d’oeil.</li>
</ol>4. Perfusion de sang rétinien
<ol><li>Injecter 200 μL de FITC-dextran (25 mg/mL) dans le ventricule gauche de la souris, qui est couramment utilisé pour l’observation de la perfusion sanguine dans les vaisseaux rétiniensde la souris 13,14.</li>
	<li>2 minutes après la circulation, enucleate les yeux et fixer dans 4% paraformaldéhyde pendant 1 heure. Les rétines ont été soigneusement obtenues et montées à plat, commeprécédemment décrit 15,et examinées par un microscope de fluorescence.</li>
	<li>Prenez des photos des montures entières rétiniennes au grossissement 4x et fusionnez en un seul à l’aide d’un analyseur de fusion,précédemment décrit 16.</li>
	<li>Mesurer les zones perfusées à l’aide d’un outil d’analyse des navires dans le logiciel NIH Fiji/ImageJ.</li>
</ol>5. Tache occidentale
<ol><li>3 et 6 heures après tBCCAO, obtenir les yeux des souris et transférer immédiatement dans une boîte de Pétri contenant du PBS froid pour isoler les rétines.</li>
	<li>Après l’isolement des rétines, effectuer des ballonnements occidentaux, comme précédemmentdécrit 9.</li>
	<li>Incuber avec des anticorps pour le facteur-1α hypoxia-inductible (HIF-1α; un marqueur général d’hypoxie) et pour β-Actin (un contrôle interne de chargement) pendant la nuit suivi de l’incubation des anticorps secondaires HRP-conjugués. Visualisez les signaux par chimioluminescence.</li>
</ol>6. PCR quantitatif (QPCR)
<ol><li>6, 12 et 24 heures après tBCCAO, traiter les rétines obtenues pour qPCR, comme précédemmentdécrit 17.</li>
	<li>Effectuez qPCR via le système PCR en temps réel. Les amorces utilisées sont énumérées dans le tableau 1. Calculer les changements de pli entre les niveaux de différentes transcriptions par la méthode ΔΔCT.</li>
</ol>7. Immunohistochimie (IHC)
<ol><li>3 jours après tBCCAO, obtenir les yeux des souris et intégrer dans la paraffine.</li>
	<li>Couper les yeux encastrés dans la paraffine par un microtome pour obtenir les sections des yeux.</li>
	<li>Dé-paraffiniser et tacher les sections oculaires de 5 μm d’épaisseur comme décrit précédemment13.</li>
	<li>Incuber avec un anticorps pour la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP; un marqueur fiable pour les astrocytes et les cellules Müller dans la rétine) pendant la nuit suivie de l’incubation de l’anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 555.</li>
	<li>Utilisez DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) pour tacher le noyau dans la rétine. Visualisez les signaux au microscope à fluorescence.</li>
	<li>Évaluer la notation morphologique par une échelle d’évaluation de 4 points, commedécrit précédemment 13,18: 0 = aucun signal, 1 = peu de pieds finaux gliale positifs dans la couche de cellules ganglionnaires (GCL), 2 = peu de processus étiquetés atteignant de GCL à la couche nucléaire externe (ONL), et 3 = la plupart des processus étiquetés atteignant de GCL à ONL.</li>
</ol>8. Électroréinographie (ERG)
<ol><li>3 et 7 jours après tBCCAO, effectuez ERG à l’aide d’un dôme Ganzfeld, d’un système d’acquisition et de stimulateurs LED, commedécrit précédemment 9.</li>
	<li>Après une adaptation sombre du jour au lendemain, anesthésier les souris avec une combinaison de MMB sous une faible lumière rouge.</li>
	<li>Utilisez une solution mixte de 0,5% de tropicamide et 0,5% de phényléphrine pour dilater les pupilles.</li>
	<li>Placez les électrodes actives sur la lentille de contact et placez l’électrode de référence dans la bouche.</li>
	<li>Obtenez des réponses ERG des deux yeux de chaque animal.</li>
	<li>Enregistrez les réponses scotopiques sous adaptation sombre avec divers stimuli.</li>
	<li>Mesurer les amplitudes d’une onde de la ligne de base au point le plus bas d’une onde.</li>
	<li>Mesurer les amplitudes de l’onde B du point le plus bas d’une onde jusqu’au pic de b-wave.</li>
	<li>Gardez toutes les souris au chaud pendant la procédure à l’aide de coussinets thermiques.</li>
</ol>9. Tomographie par cohérence optique (OCT)
<ol><li>2 semaines après tBCCAO, effectuer oct en utilisant le système SD-OCT, comme précédemment signalé8,9.</li>
	<li>Pour la mesure, soumettre les souris à la mydriase par une solution mixte de 0,5% de tropicamide et 0,5% de phényléphrine, et à l’anesthésie générale par un mélange de MMB.</li>
	<li>Obtenez des images de balayage B à partir de tranches équatoriales de scans en face.</li>
	<li>Examiner les rétines à 0,2, 0,4 et 0,6 mm de la tête du nerf optique.</li>
	<li>Mesurez l’épaisseur rétinienne de la couche de fibres nerveuses rétiniennes (NFL) à la membrane limite externe (ELM), et considérez la moyenne des valeurs mesurées comme l’épaisseur rétinienne d’une souris individuelle.</li>
	<li>Tracez les résultats sous forme de diagrammes d’araignées.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans l’étude, nous avons montré que tBCCAO, utilisant des sutures simples et une pince, pourrait induire l’ischémie rétinienne et le dysfonctionnement rétinien qui l’accompagne. En outre, nous avons démontré notre protocole actuel pour le développement d’un modèle de souris de l’ischémie rétinienne est plus facile et plus rapide par rapport à d’autres protocoles précédents pour le développement de modèles de lésions ischémiquesrétiniennes 2,<sup class="xre...

La rétine est un tissu neurosensoriel pour la fonction visuelle. Puisqu’une quantité substantielle d’oxygène est nécessaire pour la fonction visuelle, la rétine est connue comme l’un des tissus exigeants en oxygène les plus élevés dans lecorps 1. La rétine est sensible aux maladies vasculaires car l’oxygène est livré par les vaisseaux sanguins. Divers types de maladies vasculaires, telles que la rétinopathie diabétique et l’occlusion des vaisseaux sanguins rétiniens (veines ou artères), peuvent induire une ischémie rétinienne. Pour étudier les mécanismes pathologiques de l’ischémie rétinienne, des modèles expérimentaux reproductibles et cliniquement pertinents de l’ischémie rétinienne sont considérés comme nécessaires. Occlusion cérébrale moyenne d’artère (MCAO) par insertion d’un filament intraluminal est la méthode la plus généralement utilisée pour le développement des modèles in vivo de rongeur de l’ischémie cérébraleexpérimentale 2,3. En raison de la proximité de l’artère ophtalmique (OpA) au MCA, les modèles mcao sont également utilisés simultanément pour comprendre la pathophysiologie de l’ischémie rétinienne4,5,6. Pour induire l’ischémie cérébrale avec l’ischémie rétinienne, de longs filaments sont typiquement insérés par incision de l’artère carotide commune (CCA) ou de l’artère carotide externe (ECA). Ces méthodes sont difficiles à exécuter, nécessitent beaucoup de temps pour terminer la chirurgie (plus de 60 minutes pour une souris), et conduisent à des variabilités élevées dans les résultats après la chirurgie7. Il reste important d’élaborer un meilleur modèle pour améliorer ces préoccupations.
Dans cette étude, nous avons simplement employé l’occlusion bilatérale transitoire courte de CCA (tBCCAO) avec des aiguilles et une pince pour induire l’ischémie rétinienne chez les souris et avons analysé des résultats typiques des dommages ischémiques dans la rétine. Dans cette vidéo, nous ferons une démonstration de la procédure tBCCAO.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Zenoaq</td>
			<td>Antisedan</td>
			<td>For anti-anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 7500 Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Meiji Seika Pharma</td>
			<td>Vetorphale</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZ-II Analyzer</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>-</td>
			<td>For an image merge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cAJc1</td>
			<td>CLEA</td>
			<td>-</td>
			<td>Mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (8H10D10) Mouse mAb</td>
			<td>CST</td>
			<td>3700</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp Forcep</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>WPI 500451</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>340-07971</td>
			<td>For IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu SD-OCT system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>R4310</td>
			<td>For OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Merk</td>
			<td>FD2000S</td>
			<td>For retinal blood perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-9000</td>
			<td>For fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatifloxacin hydrate</td>
			<td>Senju Pharmaceutical</td>
			<td>Gachifuro</td>
			<td>For anti-bacterial infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>For IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Marukan</td>
			<td>RH-200</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1&#945; (D1S7W) XP Rabbit mAb</td>
			<td>CST</td>
			<td>36169</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000 mini</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>-</td>
			<td>For chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Sandoz K.K</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Tissue-Tek TEC 6</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>-</td>
			<td>For sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Corporation</td>
			<td>Domitor</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Handaya</td>
			<td>HS-2307</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuREC</td>
			<td>MAYO Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>For ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyaluronate</td>
			<td>Santen Pharmaceutical</td>
			<td>Hyalein</td>
			<td>For eye lubrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide/Penylephrine hydrochloride</td>
			<td>Santen Pharmaceutical</td>
			<td>Mydrin-P</td>
			<td>For mydriasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 silk suture</td>
			<td>Natsume</td>
			<td>E12-60N2</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of ischemic retinal injury induced by transient bilateral common carotid artery occlusion

Diverses maladies vasculaires telles que la rétinopathie diabétique, l’occlusion des veines rétiniennes ou des artères et le syndrome ischémique oculaire peuvent mener à l’ischémie rétinienne. Pour étudier les mécanismes pathologiques de l’ischémie rétinienne, des modèles expérimentaux pertinents doivent être développés. Anatomiquement, un vaisseau principal d’approvisionnement en sang rétinien est l’artère ophtalmique (OpA) et opa provient de l’artère carotide interne de l’artère carotide commune (CCA). Ainsi, la perturbation de la CCA pourrait effectivement causer l’ischémie rétinienne. Ici, nous avons établi un modèle de souris de l’ischémie rétinienne par occlusion commune transitoire d’artère carotide (tBCCAO) pour attacher le CCA droit avec des sutures de soie 6-0 et pour occluser le CCA gauche transitoirement pendant 2 secondes par l’intermédiaire d’une pince, et avons prouvé que tBCCAO pourrait induire l’ischémie rétinienne aiguë menant au dysfonctionnement rétinien. La méthode actuelle réduit la dépendance aux instruments chirurgicaux en utilisant seulement des aiguilles chirurgicales et une pince, raccourcit le temps d’occlusion pour réduire au minimum la mort animale inattendue, qui est souvent vue dans les modèles de souris de l’occlusion cérébrale moyenne d’artère, et maintient la reproductibilité des résultats ischémiques rétiniens communs. Le modèle peut être utilisé pour étudier la pathophysiologie des rétinopathies ischémiques chez la souris et peut être utilisé pour le dépistage des médicaments in vivo.

Après la circulation systémique du FITC-dextran pendant 2 minutes, des vasculatures rétiniennes des rétines gauche et droite dans les souris sham-operated et les souris tBCCAO-actionnées ont été examinées(figure supplémentaire 1). Fitc-dextran était entièrement visible dans les deux rétines chez les souris opérées par imposture et la rétine gauche chez les souris opérées par tBCCAO, alors qu’elle était partiellement détectable dans la rétine droite chez les souris opérées par tBCC...

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A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

Ici, nous décrivons un modèle de souris de l’ischémie rétinienne par occlusion commune transitoire d’artère carotide utilisant des sutures simples et une pince. Ce modèle peut être utile pour comprendre les mécanismes pathologiques de l’ischémie rétinienne provoquées par des anomalies cardio-vasculaires.

Un modèle murin des dommages rétiniens ischémiques induits par occlusion commune transitoire d’artère carotide

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...

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7.4K vues.  Keio University School of Medicine. Ici, nous décrivons un modèle de souris de l’ischémie rétinienne par occlusion commune transitoire d’artère carotide utilisant des sutures simples et une pince. Ce modèle peut être utile pour comprendre les mécanismes pathologiques de l’ischémie rétinienne provoquées par des anomalies cardio-vasculaires.

Vidéo: A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified version of carotid partial ligation methods [1,2] to show that it acutely induces low and oscillatory flow conditions, two key characteristics of disturbed flow, in the mouse common carotid artery. Using this model, we have provided direct evidence that disturbed flow indeed leads to rapid and robust atherosclerosis development in Apolipoprotein E knockout mouse [3]. We also developed a method of endothelial RNA preparation with high purity from the mouse carotid intima [3]. Using this mouse model and method, we found that partial ligation causes endothelial dysfunction in a week, followed by robust and rapid atheroma formation in two weeks in a hyperlipidemic mouse model along with features of complex lesion formation such as intraplaque neovascularization by four weeks. This rapid in vivo model and the endothelial RNA preparation method could be used to determine molecular mechanisms underlying flow-dependent regulation of vascular biology and diseases. Also, it could be used to test various therapeutic interventions targeting endothelial dysfunction and atherosclerosis in considerably reduced study duration.

This describes a partial carotid ligation surgery, which causes disturbed flow conditions and subsequent atherosclerosis development (in two weeks) with intraplaque neo-vascularization (in four weeks) in the mouse common carotid artery. We also describe a novel method of RNA isolation from the carotid intima, providing high purity endothelial RNA.

Un modèle de Disturbed flux athérosclérose induite chez la souris artère carotide par ligature partielle et une méthode simple d&#39;isolement d&#39;ARN de l&#39;endothélium carotidienne

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

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Médecine

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Occlusion bilatérale de l&#39;artère carotide commune comme un stimulus suffisant pour provoquer le préconditionnement précoce Tolérance ischémique à une ischémie cérébrale focale

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

L&#39;endothéline-1 induite Moyen Modèle occlusion de l&#39;artère cérébrale pour AVC ischémique avec guidage laser Doppler chez le rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

Adulte souris veineuse Modèle d&#39;hypertension: l&#39;artère carotide commune à externe Veine jugulaire anastomose.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Exécution distale permanente Moyen cérébrale avec l&#39;artère carotide commune occlusion chez les rats âgés pour étudier corticale ischémie avec une incapacité prolongée

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Transitoire cérébrale moyenne Artère Occlusion Modèle de l&#39;AVC néonatale chez les rats P10

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

In Vivo Transfert de gènes à l’endothélium de l’artère carotide commune lapin

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Un modèle de lapin d’Expression du transgène durables dans la veine jugulaire à des greffes d’Interposition artère carotide commune

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, we have translated a vascular injury model from a small animal into a large animal (canine), with slight modifications that can be used for pre-clinical screening of prophylactic and thrombolytic agents. In addition to the surgical methods, the modified protocol describes the step-by-step methods to assess carotid artery canalization by angiography, detailed instructions to process both the brain and carotid artery for histological analysis to verify carotid canalization and cerebral hemorrhage, and specific parameters to complete an assessment of downstream thromboembolic events by utilizing magnetic resonance imaging (MRI). In addition, specific procedural changes from the previously well-established small animal model necessary to translate into a large animal (canine) vascular injury are discussed.

Here, we present the modifications necessary to a well characterized and commonly used small animal ferric chloride-induced (FeCl3) carotid artery injury model for use in a large animal vascular injury model. The resulting model can be utilized for pre-clinical trial assessment of both prophylactic and thrombolytic pharmacological and mechanical interventions.

Thrombose de l’artère carotide Canine induite par le chlorure ferrique : Un grand modèle Animal de lésion vasculaire

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

Occlusion de l’artère cérébrale moyenne permettant une Reperfusion par l’intermédiaire de réparation de l’artère carotide commune chez les souris

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...