Questo lavoro è stato supportato da Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 a Toshihide Kurihara e 20K18393 a Yukihiro Miwa) del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT).

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Keio University School of Medicine.
1. Preparazione di strumenti chirurgici e animali
<ol><li>Autoclave strumenti chirurgici e tenerli in 70% alcol etilico. Prima di ogni nuova procedura chirurgica, pulire accuratamente gli strumenti chirurgici utilizzando il 70% di alcol etilico.</li>
	<li>Preparare topi BALB/cAJc1 maschi (6 settimane, 26-28 kg) in una stanza priva di agenti patogeni specifici (SPF) per mantenere condizioni sterili prima, durante e dopo l'intervento chirurgico.</li>
</ol>2. Occlusione dell'arteria carotide comune bilaterale transitoria (tBCCAO)
<ol><li>Mettere un topo in anestesia mediante iniezione intraperitoneale con una combinazione di midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) e tartrato butorfannolo (50 μg/100 μL), detto "MMB", come descritto in precedenza8,9. Tenere le skin della schiena del mouse per evitare che il mouse sbatta gli occhi fino a quando il mouse non viene completamente anestetizzato.<ol>
<li>Giudicare la profondità dell'anestesia pizzicando la dita del mouse fino a quando non ha risposta, di cui il metodo viene comunemente utilizzato per controllare l'anestesia completa10. NOTA: Generalmente, sono necessari meno di 5 minuti affinché i topi si addormentino. Le ricette corrette per l'anestesia generale possono essere diverse dalle istituzioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Applicare una goccia di soluzione di caduta oculare ialuronato di sodio purificata allo 0,1% sugli occhi per prevenire la secchezza degli occhi in anestesia.</li>
	<li>Posizionare il mouse sulla schiena e fissare le zampe del mouse utilizzando nastri adesivi.</li>
	<li>Disinfettare l'area del collo del mouse usando il 70% di alcol etilico prima dell'intervento chirurgico. NOTA: Il ritaglio aggiuntivo della pelliccia non è stato eseguito in quanto ciò può causare successivainfiammazione della pelle 11,12.</li>
	<li>Eseguire l'incisione sagittale del collo con una lama (Figura 1). NOTA: L'incisione deve essere effettuata sulla linea mediana tra collo, sterno e trachea.</li>
	<li>Separare attentamente entrambe le ghiandole salivari usando due forcep e mobilitarle per visualizzare le CTA sottostanti.</li>
	<li>Isolare attentamente il CCA destro dai rispettivi nervi vagali e dalle vene di accompagnamento senza danneggiare le loro strutture e posizionare due suture di seta 6-0 sotto il CCA. Legare saldamente le due cravatte per bloccare il flusso sanguigno (Figura 1). NOTA: Durante la procedura, piccole vene potrebbero essere danneggiate. Se si vede sanguinamento, è necessario pulire per visualizzare chiaramente i CCA.</li>
	<li>Trovare il CCA sinistro con attenzione dai rispettivi nervi vagali e dalle vene di accompagnamento senza danneggiare le loro strutture e occludere il CCA sinistro per 2 secondi da un morsetto (Figura 1). NOTA: È necessario posizionare un ago da sutura di seta 6-0 sotto il CCA sinistro per contrassegnare un sito per il bloccaggio.</li>
	<li>Dopo la riapertura del CCA sinistro, le ferite da sutura del collo da una sutura di seta 6-0 e applicare un tampone di antibiotico (50 μL) sul collo per inibire l'infezione batterica. NOTA: Rimuovere dolcemente un morsetto per evitare di danneggiare la parete arteriosa durante la riapertura del CCA sinistro.</li>
	<li>Iniettare 0,75 mg/kg di atipamezolo cloridrato per via intraperitoneale al topo per aiutare il topo a recuperare rapidamente dall'anestesia profonda. Riportare il mouse in una gabbia per topi con cuscinetti preriscaldati. NOTA: Non lasciare il mouse lasciato incustodito fino a quando il mouse non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la reclinanza sternale.</li>
	<li>Iniettare 0,4 mg/kg di tartrato di butorfanolo al topo per la gestione del dolore quando il topo si sveglia. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Come primo suggerimento per il successo del tBCCAO, si può osservare lo sbavatura delle palpebre del topo (Figura 2).</li>
	<li>Per l'eutanasia, iniettare 3 volte di miscela di MMB ai topi e sacrificarli per esperimenti.</li>
</ol>3. Osservazioni generali (tassi di sopravvivenza e sbavatura palpebrali)
<ol><li>Dopo l'intervento chirurgico, controllare i tassi di sopravvivenza per tutte le cause di morte al giorno 0 (dopo l'intervento chirurgico), 1, 3 e 7.</li>
	<li>Valutare lo sbavatura delle palpebre con una scala di valutazione di 4 punti: 1 = nessun cadente, 2 = lieve sbavatura (~50%), 3 = grave sbavatura (oltre il 50%) e 4 = grave sbavatura con scarica oculare.</li>
</ol>4. Perfusione di sangue retinica
<ol><li>Iniettare 200 μL di FITC-dextran (25 mg/mL) nel ventricolo sinistro del topo, che è comunemente usato per l'osservazione della perfusione di sangue nei vasi retinici deltopo 13,14.</li>
	<li>2 minuti dopo la circolazione, enucleare gli occhi e fissare in paraformaldeide al 4% per 1 ora. Le retine sono state accuratamente ottenute e montate in piano, come descrittoin precedenza 15, ed esaminate tramite un microscopio a fluorescenza.</li>
	<li>Scattare fotografie dei supporti integrali retini con ingrandimento 4x e unirsi in un unico utilizzando un analizzatore di unione, descritto in precedenza16.</li>
	<li>Misurare le aree perfuse tramite uno strumento di analisi delle navi nel software NIH Fiji/ImageJ.</li>
</ol>5. Macchia occidentale
<ol><li>3 e 6 ore dopo il tBCCAO, ottenere gli occhi dei topi e trasferire immediatamente in una piastra di Petri contenente PBS freddo per isolare le retine.</li>
	<li>Dopo l'isolamento delle retine, eseguire l'assorbimento occidentale, come descritto in precedenza9.</li>
	<li>Incubare con anticorpi per fattore ipossia-inducibile-1α (HIF-1α; un marcatore di ipossia generale) e per β-Actin (un controllo interno del carico) durante la notte seguito dall'incubazione di anticorpi secondari coniugati con HRP. Visualizza i segnali tramite chemiluminescenza.</li>
</ol>6. PCR quantitativo (qPCR)
<ol><li>6, 12 e 24 ore dopo tBCCAO, elaborare le retine ottenute per qPCR, come descritto in precedenza17.</li>
	<li>Eseguire qPCR tramite sistema PCR in tempo reale. I primer utilizzati sono elencati nella tabella 1. Calcola le variazioni di piegatura tra i livelli di trascrizioni diverse con il metodo ΔΔCT.</li>
</ol>7. Immunoistochimica (IHC)
<ol><li>3 giorni dopo tBCCAO, ottenere gli occhi dei topi e incorporare in paraffina.</li>
	<li>Tagliare gli occhi incorporati nella paraffina con un microtomo per ottenere le sezioni oculari.</li>
	<li>De-paraffinare e macchiare le sezioni oculari di 5 μm di spessore come descritto in precedenza13.</li>
	<li>Incubare con un anticorpo per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP; un marcatore affidabile per astrociti e cellule di Müller nella retina) durante la notte seguito dall'incubazione di anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor 555.</li>
	<li>Utilizzare DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) per macchiare il nucleo nella retina. Visualizza i segnali tramite un microscopio a fluorescenza.</li>
	<li>Valutare il punteggio morfologico in base a una scala di valutazione di 4 punti, come descritto inprecedenza 13,18: 0 = nessun segnale, 1 = pochi piedi finali gliali positivi nello strato di cellule gangliari (GCL), 2 = pochi processi etichettati che vanno dal GCL allo strato nucleare esterno (ONL) e 3 = processi più etichettati che vanno da GCL a ONL.</li>
</ol>8. Elettroretinografia (ERG)
<ol><li>3 e 7 giorni dopo tBCCAO, eseguire ERG utilizzando una cupola di Ganzfeld, un sistema di acquisizione e stimolatori LED, come descritto in precedenza9.</li>
	<li>Dopo l'adattamento scuro durante la notte, anestetizza i topi con una combinazione di MMB sotto la luce rossa fioca.</li>
	<li>Utilizzare una soluzione mista dello 0,5% di tropicamide e dello 0,5% di fenilefrina per dilatare le pupille.</li>
	<li>Posizionare gli elettrodi attivi sulla lente a contatto e posizionare l'elettrodo di riferimento in bocca.</li>
	<li>Ottenere risposte ERG da entrambi gli occhi di ogni animale.</li>
	<li>Registra le risposte scotopiche sotto l'adattamento oscuro con vari stimoli.</li>
	<li>Misurare le ampiezze di un'onda dalla linea di base al punto più basso di un'onda.</li>
	<li>Misurare le ampiezze dell'onda b dal punto più basso di un'onda al picco dell'onda b.</li>
	<li>Tenere tutti i topi al caldo durante la procedura utilizzando termoscapacchi.</li>
</ol>9. Tomografia a coerenza ottica (PTOM)
<ol><li>2 settimane dopo tBCCAO, eseguire lo Strumento di personalizzazione di Office utilizzando il sistema SD-OCT, comeprecedentemente riportato 8,9.</li>
	<li>Per la misurazione, sottoscrivi i topi alla mioriasi con una soluzione mista dello 0,5% di tropicamide e 0,5% di fenilefrina e all'anestesia generale da una miscela di MMB.</li>
	<li>Ottenere immagini di scansione B da fette equatoriali di scansioni en-face.</li>
	<li>Esaminare le retine a 0,2, 0,4 e 0,6 mm dalla testa del nervo ottico.</li>
	<li>Misurare lo spessore retinico dallo strato di fibra nervosa retinica (NFL) alla membrana limitante esterna (ELM), e considerare la media dei valori misurati come spessore retinico di un singolo topo.</li>
	<li>Traccia i risultati come diagrammi a ragno.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nello studio, abbiamo dimostrato che il tBCCAO, utilizzando suture semplici e un morsetto, potrebbe indurre ischemia retinica e conseguente disfunzione retinica. Inoltre, abbiamo dimostrato che il nostro attuale protocollo per lo sviluppo di un modello di topo di ischemia retinica è più facile e veloce rispetto ad altri protocolli precedenti per lo sviluppo di modelli di lesioni ischemiche retiniche2,3,7.
<p class="jove_co...

La retina è un tessuto neurosensoriale per la funzione visiva. Poiché è necessaria una notevole quantità di ossigeno per la funzione visiva, la retina è conosciuta come uno dei tessuti più esigenti di ossigeno nel corpo1. La retina è suscettibile alle malattie vascolari poiché l'ossigeno viene fornito attraverso i vasi sanguigni. Vari tipi di malattie vascolari, come la retinopatia diabetica e il vaso sanguigno retinale (vene o arterie) occlusione, possono indurre ischemia retinica. Per studiare i meccanismi patologici dell'ischemia retinica, sono considerati necessari modelli sperimentali riproducibili e clinicamente rilevanti di ischemia retinica. L'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) mediante inserimento di un filamento intraluminale è il metodo più generalmente utilizzato per lo sviluppo di modelli di roditori in vivo di ischemia cerebrale sperimentale2,3. A causa della vicinanza dell'arteria oftalmica (OpA) a MCA, i modelli MCAO vengono utilizzati anche contemporaneamente per comprendere la fisiopatologia dell'ischemia retinica4,5,6. Per indurre l'ischemia cerebrale insieme all'ischemia retinica, i filamenti lunghi vengono tipicamente inseriti attraverso l'incisione della comune arteria carotide (CCA) o dell'arteria carotide esterna (ECA). Questi metodi sono difficili da eseguire, richiedono molto tempo per completare l'intervento chirurgico (oltre 60 minuti per un topo) e portano ad alte variabilità nei risultati dopo l'interventochirurgico 7. Resta importante sviluppare un modello migliore per migliorare tali preoccupazioni.
In questo studio, abbiamo semplicemente usato breve occlusione bilaterale CCA transitoria (tBCCAO) con aghi e un morsetto per indurre l'ischemia retinica nei topi e analizzato i risultati tipici delle lesioni ischemiche nella retina. In questo video, daremo una dimostrazione della procedura tBCCAO.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Zenoaq</td>
			<td>Antisedan</td>
			<td>For anti-anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 7500 Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Meiji Seika Pharma</td>
			<td>Vetorphale</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZ-II Analyzer</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>-</td>
			<td>For an image merge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cAJc1</td>
			<td>CLEA</td>
			<td>-</td>
			<td>Mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (8H10D10) Mouse mAb</td>
			<td>CST</td>
			<td>3700</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp Forcep</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>WPI 500451</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>340-07971</td>
			<td>For IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu SD-OCT system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>R4310</td>
			<td>For OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Merk</td>
			<td>FD2000S</td>
			<td>For retinal blood perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-9000</td>
			<td>For fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatifloxacin hydrate</td>
			<td>Senju Pharmaceutical</td>
			<td>Gachifuro</td>
			<td>For anti-bacterial infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>For IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Marukan</td>
			<td>RH-200</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1&#945; (D1S7W) XP Rabbit mAb</td>
			<td>CST</td>
			<td>36169</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000 mini</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>-</td>
			<td>For chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Sandoz K.K</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Tissue-Tek TEC 6</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>-</td>
			<td>For sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Corporation</td>
			<td>Domitor</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Handaya</td>
			<td>HS-2307</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuREC</td>
			<td>MAYO Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>For ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyaluronate</td>
			<td>Santen Pharmaceutical</td>
			<td>Hyalein</td>
			<td>For eye lubrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide/Penylephrine hydrochloride</td>
			<td>Santen Pharmaceutical</td>
			<td>Mydrin-P</td>
			<td>For mydriasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 silk suture</td>
			<td>Natsume</td>
			<td>E12-60N2</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of ischemic retinal injury induced by transient bilateral common carotid artery occlusion

Diverse malattie vascolari come la retinopatia diabetica, l'occlusione delle vene o delle arterie retiniche e la sindrome ischemica oculare possono portare all'ischemia retinica. Per studiare i meccanismi patologici dell'ischemia retinica, è necessario sviluppare modelli sperimentali pertinenti. Anatomicamente, un principale vaso di alimentazione del sangue retinica è l'arteria oftalmica (OpA) e OpA ha origine dall'arteria carotide interna della comune arteria carotide (CCA). Pertanto, l'interruzione del CCA potrebbe effettivamente causare ischemia retinica. Qui, abbiamo stabilito un modello di topo di ischemia retinica mediante occlusione dell'arteria carotide comune bilaterale transitoria (tBCCAO) per legare il CCA destro con suture di seta 6-0 e per occludere il CCA sinistro transitoriamente per 2 secondi tramite un morsetto, e abbiamo dimostrato che tBCCAO potrebbe indurre ischemia retinica acuta che porta alla disfunzione retinica. L'attuale metodo riduce la dipendenza dagli strumenti chirurgici utilizzando solo aghi chirurgici e un morsetto, riduce i tempi di occlusione per ridurre al minimo la morte animale inaspettata, che è spesso vista nei modelli di topo dell'occlusione dell'arteria cerebrale media e mantiene la riproducibilità dei comuni risultati ischemici retinali. Il modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia delle retinopatie ischemiche nei topi e ulteriormente può essere utilizzato per lo screening in vivo dei farmaci.

Dopo la circolazione sistemica del FITC-dextran per 2 minuti, sono state esaminate le vasculure retiniche delle retine sinistra e destra nei topi azionati da sham e nei topi azionati da tBCCAO (Figura complementare 1). Fitc-dextran era completamente visibile sia nelle retine nei topi a farsa che nella retina sinistra nei topi azionati da tBCCAO, mentre era parzialmente rilevabile nella retina destra nei topi azionati da tBCCAO.
Dopo il tBCCAO, è stato esaminato lo sbavatura d...

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A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

Qui, descriviamo un modello di topo di ischemia retinica mediante occlusione bilaterale transitoria comune dell'arteria carotide usando suture semplici e un morsetto. Questo modello può essere utile per comprendere i meccanismi patologici dell'ischemia retinica causati da anomalie cardiovascolari.

Un modello murino di lesione retinica ischemica indotta dall'occlusione dell'arteria carotide comune transiente

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...

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7.3K Views.  Keio University School of Medicine. Qui, descriviamo un modello di topo di ischemia retinica mediante occlusione bilaterale transitoria comune dell'arteria carotide usando suture semplici e un morsetto. Questo modello può essere utile per comprendere i meccanismi patologici dell'ischemia retinica causati da anomalie cardiovascolari.

Video: A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified version of carotid partial ligation methods [1,2] to show that it acutely induces low and oscillatory flow conditions, two key characteristics of disturbed flow, in the mouse common carotid artery. Using this model, we have provided direct evidence that disturbed flow indeed leads to rapid and robust atherosclerosis development in Apolipoprotein E knockout mouse [3]. We also developed a method of endothelial RNA preparation with high purity from the mouse carotid intima [3]. Using this mouse model and method, we found that partial ligation causes endothelial dysfunction in a week, followed by robust and rapid atheroma formation in two weeks in a hyperlipidemic mouse model along with features of complex lesion formation such as intraplaque neovascularization by four weeks. This rapid in vivo model and the endothelial RNA preparation method could be used to determine molecular mechanisms underlying flow-dependent regulation of vascular biology and diseases. Also, it could be used to test various therapeutic interventions targeting endothelial dysfunction and atherosclerosis in considerably reduced study duration.

This describes a partial carotid ligation surgery, which causes disturbed flow conditions and subsequent atherosclerosis development (in two weeks) with intraplaque neo-vascularization (in four weeks) in the mouse common carotid artery. We also describe a novel method of RNA isolation from the carotid intima, providing high purity endothelial RNA.

Un modello di Disturbed flusso indotta aterosclerosi carotidea in Arteria mouse da legatura parziale e un semplice metodo di isolamento dell&#39;RNA da Endotelio carotidea

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

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Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Bilaterale occlusione comune Arteria carotide come uno stimolo precondizionamento in grado di indurre tolleranza ischemica precoce di focale Ischemia Cerebrale

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

L&#39;endotelina-1 indotta cerebrale media occlusione dell&#39;arteria modello per l&#39;ictus ischemico con guida laser flussimetria Doppler in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

Topo adulto venosa Ipertensione Modello: carotide comune di External Vena giugulare anastomosi.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Esecuzione permanente distale Medio cerebrale con arteria carotide comune di occlusione in ratti anziani per studiare corticale Ischemia con disabilità sostenuta

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Transient Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale Modello di Stroke neonatale nei ratti P10

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

In Vivo Trasferimento del gene per l'endotelio dell'arteria carotica comune di coniglio

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Un modello del coniglio di espressione del Transgene durevole nella vena giugulare di innesti di interposizione dell'arteria carotica comune

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, we have translated a vascular injury model from a small animal into a large animal (canine), with slight modifications that can be used for pre-clinical screening of prophylactic and thrombolytic agents. In addition to the surgical methods, the modified protocol describes the step-by-step methods to assess carotid artery canalization by angiography, detailed instructions to process both the brain and carotid artery for histological analysis to verify carotid canalization and cerebral hemorrhage, and specific parameters to complete an assessment of downstream thromboembolic events by utilizing magnetic resonance imaging (MRI). In addition, specific procedural changes from the previously well-established small animal model necessary to translate into a large animal (canine) vascular injury are discussed.

Here, we present the modifications necessary to a well characterized and commonly used small animal ferric chloride-induced (FeCl3) carotid artery injury model for use in a large animal vascular injury model. The resulting model can be utilized for pre-clinical trial assessment of both prophylactic and thrombolytic pharmacological and mechanical interventions.

Trombosi dell'arteria carotica canini cloruro ferrico-indotta: Un grande modello animale di danno vascolare

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

Occlusione dell'arteria cerebrale centrale consentendo di riperfusione tramite riparazione dell'arteria carotica comune nei topi

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...