Ce protocole fournit des paramètres expérimentaux pour effectuer des co-cultures 2D et 3D contrôlables dans des micro-dispositifs afin de visualiser et de surveiller les diaphonies tumorales-cellules immunitaires et d’analyser les effets des traitements anticancéreux. Cette technologie fournit une visualisation facile et en temps réel du recrutement et des interactions des cellules immunitaires et peut être utilisée pour les échantillons humains et dérivés du patient. Il est compatible avec la plupart des microscopies de pointe.
Francesco Noto, doctorant au Département d’oncologie et de médecine moléculaire, Istituto Superiore di Sanita, et Nicoleta Manduca et Esther Maccafeo, doctorantes à l’Universita Cattolica del Sacro Cuore, Département de médecine translationnelle et de chirurgie, feront la démonstration de la procédure. Les puces sont préalablement activées par plasma dans un nettoyeur plasma ou une machine de gravure de fer réactive en salle blanche. Des cellules de rate murine et une lignée cellulaire tumorale sont utilisées ici pour imiter les protocoles décrits dans le texte.
Avant de charger les suspensions cellulaires, retirer le média des six réservoirs. Puis chargez lentement 1 x 10 à la 5ème cellule tumorale remise en suspension dans 10 à 50 microlitres de milieu de croissance dans le réservoir supérieur gauche et le puits inférieur. Sur le côté droit, pipeter doucement 1 x 10 à la 6ème cellules immunitaires flottantes remises en suspension dans 50 microlitres de milieu de croissance dans deux puits.
Lorsque toutes les cellules ont été ajoutées, remplissez les six réservoirs de chaque puce avec jusqu’à 100 à 150 microlitres de milieu de croissance et vérifiez que les cellules ont été correctement réparties dans chaque compartiment de culture. Incuber la puce pendant une heure pour permettre au système de se stabiliser avant l’enregistrement accéléré. Pour l’imagerie de cellules vivantes, montez la tumeur immunitaire sur la plaque de puce sur la scène du microscope.
Personnalisez le paramètre de flux de travail d’acquisition dans l’interface du logiciel de microscope, tel que le logiciel d’analyse de cellules vivantes d’incucytes. Sélectionnez les fenêtres d’observation, la fréquence d’images optimale et la durée de temps, en fonction des paramètres appropriés pour l’expérience et les types de cellules à l’étude. Imagez les cellules pour la période expérimentale appropriée.
Préparer deux aliquotes de matrigel dilué avec un milieu contenant un médicament ou une combinaison de médicaments pour les deux conditions expérimentales en utilisant des pointes froides. Pipeter doucement des cellules tumorales colorées par colorant fluorescent compatibles avec la vie en suspension dans une solution matricielle sur de la glace pour obtenir une distribution homogène des cellules. Avec la plaque de puce sur un bloc de refroidissement ou sur un panier avec de la glace, injectez lentement la solution de matrice cellulaire tumorale traitée par le médicament dans les ports de gel gauche et droit à l’aide d’embouts de micropipette froide de 10 microlitres.
Appliquez une légère pression pour pousser la solution matricielle d’un côté du canal à l’autre. Lorsque toutes les cellules tumorales ont été chargées, placez le dispositif dans l’incubateur en position verticale pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, une fois la gélification matricielle terminée, remplissez les canaux intermédiaires des six réservoirs avec 50 microlitres de milieu de culture.
Vérifiez l’intégrité du gel polymérisé et la distribution des cellules tumorales au microscope. Ensuite, placez les puces dans un incubateur jusqu’à ce que la préparation des cellules immunitaires soit terminée. Après l’incubation, aspirez le milieu de chaque puits.
Placez l’embout près de l’entrée du canal moyen moyen et utilisez une pression modérée pour injecter doucement 10 microlitres de 10 à la 6ème cellule immunitaire marquée avec un colorant fluorescent contrastant. Injecter 50 à 100 microlitres du milieu dans chacun des quatre puits de canaux latéraux, 40 à 90 microlitres du milieu dans le puits central supérieur et 50 à 100 microlitres du milieu dans le puits central inférieur. Lorsque tous les puits ont été chargés, utilisez un microscope pour confirmer que la distribution des cellules immunitaires est restée confinée à la chambre centrale.
Ensuite, placez soigneusement le dispositif sur une surface plane dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à l’imagerie. Pour calculer l’étendue des cellules immunitaires vivantes colorées par fluorescence infiltrant les compartiments tumoraux, imagez l’appareil à des moments spécifiques d’intérêt par microscopie à fluorescence et définissez les paramètres appropriés de la caméra dans le logiciel d’imagerie au microscope, tel que Nikon NIS-Elements. Définissez également les paramètres pour les cellules immunitaires marquées.
Le mouvement des leucocytes à travers des ponts microcanaux convenablement construits dans la plate-forme microfluidique vers leurs cellules cibles peut être suivi par microscopie vidéo. Dans cette analyse de suivi, les PBMC individuels ont été confrontés à la mort de cellules cancéreuses traitées à la doxorubicine ou vivantes traitées par PBS. Les valeurs de chimiotaxie pertinentes et les diagrammes de migration ont été générés automatiquement, et un profil migratoire différent pour les cellules immunitaires a été observé lorsqu’elles étaient cochargées avec des cellules cancéreuses du sein exposées à la doxorubicine ou au PBS.
Lorsque les PBMC ont été confrontés à des cellules cancéreuses apoptotiques, ils ont traversé des microcanaux vers les cellules mourantes et mortes, mais n’ont pas traversé pour des cellules vivantes non traitées. Une fraction de leucocytes avec une densité croissante sur 24 à 48 heures a présenté des contacts à long terme avec des cellules cancéreuses doxo-traitées. Dans cette analyse, un nouveau modèle tumoral immunocompétent 3D a été utilisé pour quantifier le recrutement de cellules immunitaires en réponse à des combinaisons anticancéreuses de médicaments épigénétiques.
Les PBMC marqués au colorant rouge ont ensuite été distribués de manière homogène dans la chambre fluidique centrale. La capacité des deux masses tumorales à attirer les PBMC a ensuite été comparée, les PBMC étant recrutés de manière robuste dans cette expérience dans le microcanal droit. Pour le modèle 3D, mélanger la solution avec de l’hydrogel et des cellules sur de la glace, en évitant les bulles et la prépolymérisation.
Injectez-le lentement sans pression excessive. Ajuster les étapes de polymérisation en fonction de la matrice utilisée. Des tests de cellules vivantes / mortes et un profilage de la sécrétion de cytokines à partir de surnageants peuvent être mis en œuvre.
L’immunofluorescence pour l’imagerie confocale peut être réalisée pour classer les sous-types immunitaires et pour les marqueurs d’expression de la maturation d’activation et d’épuisement.
