La technologie des micro-réseaux phénotypiques est une méthode efficace à haut débit qui détermine fonctionnellement les activités métaboliques cellulaires en réponse à un large éventail de métabolites d’entrée. L’utilisation dans cette technologie est mesurée sous la forme d’une respiration cellulaire déterminée par la quantité de développement de couleur produite par la réduction NADH d’un colorant redox à base de tétrazolium. Dans ce travail, nous introduirons l’utilisation de tests de microrésement phénotypiques dans le contexte de micro-algues en utilisant l’espèce modèle Chlamydomonas reinhardtii.
L’objectif de cette étude est d’établir une méthode fiable pour caractériser le phénotypage métabolique des micro-algues qui peut être utilisée pour étendre les modèles de réseau métabolique d’algues existants ou guider la reconstruction de nouveaux modèles. La souche CC-503 de Chlamydomonas reinhardtii peut être obtenue auprès du centre de ressources Chlamydomonas de l’Université du Minnesota aux États-Unis. Cultiver les cellules dans des milieux de graisse de phosphate de tris-acétate frais jusqu’à la phase médiane logarithmique.
Vérifiez les cellules au microscope pour vous assurer qu’elles sont en bon état et sans aucune contamination. Faites tourner la culture à 2000 G-force pendant 10 minutes. Jetez le surnageant sans déranger la pastille.
Préparez des milieux frais contenant 0,1% de colorant violet tétrazolium D"Ajoutez différents antibiotiques, notamment timentin, ampicilline et kanamycine, au milieu pour inhiber la croissance bactérienne. Les milieux gras et cette étape doivent être omis des nutriments, en fonction de chaque type de plaque. Ressés suspendez la pastille et le milieu frais du robinet jusqu’à une concentration finale de 1 million de cellules par millilitre.
Utilisez des plaques d’essai de réseau de composés chimiques, telles que des sources de carbone, des sources d’azote, des plaques de sources de phosphore et de soufre, et les sources d’azote peptidique. Inoculer 100 microlitres adéquats de supports autonomes dans chaque puits des plaques d’essai. Assurez-vous de dupliquer les tests.
Il convient de noter qu’à ce stade, les cellules doivent être testées avec une coloration à Gram négatif avant et après le test pour surveiller la contamination bactérienne. Insérez les plaques d’essai de la zone de composé chimique dans le système de lecteur de microplaques. Incuber toutes les plaques à 30 degrés pendant sept jours et programmez le système de lecteur de microplaques pour lire le changement de couleur du colorant toutes les 15 minutes.
Comme la plupart des lecteurs de microplaques ne fournissent pas de source de lumière continue pendant l’incubation, les algues devraient pouvoir effectuer une respiration hétérotrophe. Exportez les données cinétiques brutes du lecteur de microplaques sous forme de fichiers CSV, qui seront ensuite utilisés comme entrée dans le progiciel de microréseau phénotypique et notre logiciel. Pour effectuer l’analyse des données du microréseau phénotypique, utilisez le progiciel OmniLog phenotype micro Erik OPM qui s’exécute dans l’environnement logiciel R.
Dans R studio, l’interface utilisateur graphique de R, installez le package OPM et ses dépendances à l’aide des commandes détaillées dans le manuscrit. Accédez au répertoire qui contient les fichiers CSV des données cinétiques et importez les données à l’aide de la fonction OPM de lecture. Les données cinétiques peuvent être agrégées et discrétisées à l’aide de l’estimation des paramètres pref.
L’utilisation de la fonction XY plot permet de cartographier les mesures de respiration ou de croissance en fonction du temps pour les plaques de dosage à 96 puits. Les données peuvent être visualisées sous forme de carte thermique à l’aide du diagramme au niveau de la fonction pour permettre un aperçu comparatif rapide des données cinétiques. L’étape suivante consiste à identifier les réactions et les gènes associés aux nouveaux métabolites.
En cas de présence d’un modèle existant pour les algues, l’analyse des données du système de microréseau phénotypique peut être utilisée pour affiner ce modèle. Nous présentons ici le pipeline que nous avons utilisé pour affiner le réseau métabolique à l’échelle du génome pour le modèle Chlamydomonas en utilisant des données de microréseau phénotypique. Lorsqu’un nouveau composé est testé positif pour l’utilisation, les profils de réaction pertinents du composé sont définis à l’aide de connaissances métaboliques, fournissant les numéros de commission d’enzyme associés.
La première étape consiste à rechercher Kegg et MetaCyc pour identifier les numéros de commission d’enzymes, ECs, pour les réactions à l’aide de métabolisés trouvés dans les réseaux de composés chimiques. Ensuite, nous utilisons les numéros EC identifiés comme base de recherche dans plusieurs ressources d’annotation d’algues disponibles, telles que le Joint Genome Institute, JGI, Phytozome et des publications évaluées par des pairs. Les réactions et les métabolites sont ajoutés au modèle de réseau métabolique de Chlamydomonas reinhardtii à base de COBRA, iRC1080, pour élargir et affiner le modèle.
Si aucune preuve génétique n’est trouvée à l’appui du numéro EC, une recherche basée sur un profil telle que NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, peut être effectuée pour identifier les gènes candidats associés à la réaction. Les résultats sont ensuite évalués manuellement. Ceux qui réussissent cette étape de contrôle qualité avec des valeurs E inférieures à 0,05 pour la pertinence par rapport aux numéros EC de recherche sont ensuite ajoutés au modèle métrique.
La dernière étape de ce protocole consiste à affiner le modèle, à évaluer et à comparer les modèles. Utilisez la dernière version 3.0 de la boîte à outils COBRA et la plate-forme MATLAB pour effectuer les étapes d’affinement du modèle. Après avoir installé la boîte à outils Cobra, vous pouvez télécharger le modèle iRC1080.
Ensuite, dans MATLAB, la première chose à faire est de naviguer vers le dossier contenant le modèle de référence, iRC1080. Ajoutez les réactions identifiées avec leurs gènes associés au modèle métabolique, comme iRC1080, à l’aide des fonctions de la boîte à outils Cobra. Ajouter la réaction et modifier l’association des gènes.
Accédez au répertoire qui contient le modèle iRC1080 et exécutez les commandes pour charger le modèle. Renommez-le et ajoutez une nouvelle réaction et son gène associé. Dans certains cas, lorsque le métabolite n’est pas produit intracellulairement, mais est prélevé dans le milieu, des réactions de transport pour les nouveaux métabolites doivent être ajoutées au modèle à l’aide de la fonction de réaction d’ajout/échange pour entrer ou sortir le métabolite dans le milieu extracellulaire.
Testez le comportement du nouveau résultat et du nouveau modèle, par exemple, iBD1106, en effectuant une analyse d’équilibre de flux, FBA, en utilisant la fonction optimiser le modèle CB dans des conditions claires et sombres pour la maximisation de la biomasse en tant que fonction objet. Entre autres, la solution Expédié par Amazon produit trois vecteurs, à déterminer les flux de réaction, les prix de l’ombre des métabolites et les coûts de réduction de la réaction. Ici, un exemple est fourni où le modèle iRC1080 est comparé à sa version raffinée, iBD1106, en obtenant les prix fictifs qui représentent la sensibilité de la fonction objectif de biomasse aux changements et métabolites pris en compte dans chaque modèle.
Ici, nous montrons des diagrammes XY de respiration et des diagrammes de niveau des sources de carbone et des plaques d’essai des sources d’azote pour l’ébauche et cc-503 en couleur sarcelle et violet, respectivement. Dans chaque puits, les courbes de respiration représentent la conversion du colorant par réduction en fonction du temps. Le pic mis en évidence dans le panneau A représente la détection de l’acétate comme seule source de carbone de cette plaque, ce qui est cohérent avec la littérature sur Chlamydomonas.
La comparaison du nombre de métabolites identifiés à l’aide de trois méthodes différentes, iRC1080, qui est le modèle métabolique bien organisé de Chlamydomonas, le temps de chromatographie en phase gazeuse du vol GC-TOF et l’essai de microréseau phénotypique montre que seulement six métabolites se chevauchent entre les trois ensembles, tandis que 149 étaient courants entre iRC1080 et l’ensemble de tests de microréseaux phénotypiques. Cela montre que, bien que chaque technologie ait une force pour la recherche sur le profilage métabolique, l’ensemble de tests de microréseau phénotype peut être une source importante de nouvelles informations métaboliques. Les informations obtenues ont été utilisées pour étendre et affiner le modèle de réseau métabolique iRC1080.
Ici, nous comparons le contenu du modèle iRC1080 et du modèle élargi iBD1106, y compris le nombre de réactions, le nombre de métabolites et le nombre de gènes. Nous montrons que l’affinement de notre modèle a ajouté plus de 254 réactions au nouveau réseau résultant. Ces réactions sont classées en acides aminés, dipeptides, tripeptides et réactions de transport.
Les métabolites nouvellement identifiés ont été utilisés pour l’expansion du réseau métabolique et le raffinement du modèle métabolique existant de Chlamydomonas reinhardtii. Les tests de microréseaux phénotypiques peuvent être utilisés pour caractériser les phénotypes métaboliques de souches existantes et nouvellement isolées. De plus, le protocole que nous avons utilisé dans le contexte des micro-algues peut guider le raffinement des modèles métaboliques d’autres espèces.
