Cette méthode peut être utilisée pour détecter avec précision et facilité l’expression des protéines cibles dans le cœur du poisson-zèbre. Le changement dans la protéine cible est directement détecté en mesurant l’immunofluorescence. Effectuer la collecte et le traitement d’embryons de poisson-zèbre, comme décrit dans le manuscrit du texte.
72 heures après la fécondation, transférez les embryons sur des lames de verre et observez-les au stéréomicroscope. Enregistrez les malformations cardiaques, telles que l’œdème péricardique, l’altération de la boucle et la diminution de la taille. Calculer les taux de malformation et analyser les différences entre les groupes en utilisant l’ANOVA à sens unique, suivie du test de comparaison multiple de la Turquie.
Après avoir anesthésique les embryons avec 0,6 milligramme par millilitre MS222, enregistrez les battements cardiaques pendant 30 secondes et quantifiez les fréquences cardiaques à l’aide du logiciel Image J. Disséquez soigneusement les cœurs des embryons de poisson zèbre avec une aiguille de seringue jetable sous un stéréomicroscope. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur une glissière en verre propre.
Ajouter 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4% à 1,25 microlitres de PBS pour obtenir une solution fixative, puis placer trois cœurs disséqués dans un cercle barrière hydrophobe et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Décantez la solution au microscope et séchez les échantillons à température ambiante pendant au moins cinq minutes. Lavez les lames trois fois dans PBST pendant cinq minutes par lavage.
Ajouter 50 microlitres de BSA à 1 000 microlitres de PBST pour obtenir une solution de BSA à 5 % et incuber les lames dans une chambre humide pendant une heure pour bloquer la liaison aux anticorps non spécifiques. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage. Diluer deux microlitres d’anticorps monoclonaux de souris contre la 8-hydroxydésoxyguanosine et deux microlitres d’anticorps polyclonaux de lapin contre le gamma-H2AX dans 296 microlitres de PBST pour obtenir une solution cocktail d’anticorps primaires fonctionnelle.
Incuber les échantillons cardiaques avec 50 microlitres de la solution primaire de cocktail d’anticorps dans une chambre humidifiée pendant au moins une heure à température ambiante ou pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBST pendant cinq minutes par lavage. Diluer un microlitre d’anticorps secondaire anti-souris de chèvre marqué fitC et un microlitre d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre psy-3 dans 500 microlitres de PBST pour obtenir une solution de cocktail d’anticorps secondaires fonctionnelle.
Incuber les échantillons avec les anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage. Ajouter 20 microlitres de DAPI aux échantillons pour la coloration nucléaire et les incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
Appliquez un couvercle sur la glissière et scellez-la avec du vernis à ongles pour éviter le séchage et le mouvement. Imagez les échantillons sous un microscope à fluorescence et quantifiez le signal fluorescent de la région cardiaque à l’aide du logiciel ImageJ. Calculer les changements relatifs à l’aide de la moyenne des échantillons témoins du DMSO et déterminer la signification statistique des données.
Les embryons exposés aux PM 2,5 en l’absence ou en présence de l’antioxydant, la N-acétyl-L-cystéine, ou NAC, ont été évalués pour la présence de malformations cardiaques. L’EOM des PM 2,5 a coûté une augmentation significative de la tératogenèse cardiaque, telle qu’un œdème péricardique, une altération de la boucle et une diminution de la taille, par rapport aux cœurs traités par DMSO. La fréquence cardiaque a également été significativement diminuée chez les embryons exposés à l’EOM.
Ajout de malformations cardiaques atténuées par EOM atténuées par le CNA. Un test d’immunofluorescence a été utilisé pour évaluer l’étendue des dommages à l’ADN dans les tissus traités par EOM. Les niveaux d’expression de 8-hydroxydésoxyguanosine et de gamma-H2AX ont été significativement augmentés dans le cœur des embryons de poisson-zèbre traités par EOM, indiquant une augmentation des dommages oxydatifs à l’ADN et des cassures double brin de l’ADN, respectivement.
Les dommages à l’ADN induits par la MOE ont été partiellement contrecarrés par la supplémentation en NAC. Lorsque vous essayez ce protocole, faites attention lorsque vous lavez les échantillons avec du PBS, car le cœur du poisson-zèbre peut se décoller de la glissière.
