Le protocole est important car il montre l’isolement et la transfection des cellules épithéliales pigmentaires de cinq mammifères comme un système optimal pour étudier la thérapie génique oculaire dans diverses configurations. Le principal avantage de cette méthode est sa flexibilité, sa transférabilité, son rendement cellulaire élevé, sa viabilité et son taux de transfection en raison des cinq espèces et du système de transposon SB100X non viral utilisé. Ces techniques ont été développées pour étudier les approches de thérapie génique ciblant les cellules épithéliales pigmentaires de la rétine et de l’iris, qui sont isolées et transfectées dans le présent protocole, mais qui sont utilisables pour toute recherche oculaire.
Gregg Sealy, un technicien du laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après avoir euthanasié l’animal, utilisez des ciseaux incurvés et des pinces Colibri pour énucléer les yeux, puis nettoyez le tissu musculaire et la peau restants des yeux. Recueillir les yeux dans un tube de 50 millilitres rempli de PBS non stérile et transférer le tube dans la hotte à écoulement laminaire.
Désinfectez-les en les immergeant dans une solution à base d’iode pendant deux minutes, puis transférez les yeux dans un tube de 50 millilitres rempli de PBS stérile. Mettez un œil sur une compresse de gaze stérile et maintenez fermement l’œil près du nerf optique. Ensuite, coupez près de la limite de l’iris avec un scalpel numéro 11.
À l’aide de ciseaux, coupez autour de l’iris et retirez le segment antérieur et mettez-le dans une boîte de Pétri, laissant le bulbe avec le vitré jusqu’à ce que les cellules épithéliales du pigment rétinien, ou RPE, soient isolées. Pour isoler les cellules épithéliales du pigment de l’iris, ou cellules IPE, retirez le cristallin avec une pince fine et retirez délicatement l’iris contenant les cellules IPE. Placez l’iris dans une boîte de Petri et lavez-le avec du PBS stérile.
Ajouter 500 microlitres de 0,25% de trypsine et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez la trypsine, ajoutez 500 microlitres de milieu complet et grattez délicatement l’IPE avec une pipette Pasteur plate et polie au feu. Recueillez la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de 1,5 millilitre.
Comptez les cellules à l’aide de la chambre de Neubauer et ensemencez 0,2 million de cellules par puits dans une plaque de 24 puits avec un millilitre de milieu complet. Placez la plaque dans un incubateur et culturez-la à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone. Pour isoler les cellules RPE, retirez l’humeur vitrée et la rétine du segment postérieur avec une pince mince.
Mettez les ampoules dans la plaque de 24 puits et ajoutez 500 microlitres de 0,25% de trypsine par œil et incubez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez la trypsine, ajoutez 500 microlitres de milieu complet par globe et grattez délicatement les cellules RPE avec une pipette Pasteur incurvée et polie au feu. Recueillez la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de 1,5 millilitre.
Comptez les cellules à l’aide de la chambre de Neubauer et ensemencez les cellules comme décrit précédemment. Placez la plaque dans l’incubateur. Nettoyez les tissus musculaires et la peau restants des yeux et désinfectez les yeux dans une solution à base d’iode et rincez-les avec du PBS.
Pour isoler les cellules IPE, retirez la lentille et retirez l’iris comme décrit précédemment. Après avoir préparé deux iris, ajoutez un millilitre de milieu complet et isolez les cellules en les grattant avec une pipette Pasteur plate et polie au feu, puis comptez et ensemencez les cellules. Placez la plaque dans l’incubateur.
Pour isoler les cellules RPE, retirez le vitré et la rétine du segment postérieur et placez le bulbe dans une boîte de Pétri. Remplissez l’ampoule avec un millilitre de milieu complet. À l’aide d’une pipette Pasteur incurvée et polie au feu, retirez les cellules RPE.
Recueillir la suspension cellulaire à l’intérieur de l’ampoule à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres et la transférer dans un tube de 1,5 millilitre pour la remise en suspension. Ensuite, comptez et ensemencez les cellules et incubez la plaque comme démontré précédemment. Après le nettoyage, ouvrez l’œil et coupez autour de l’iris pour enlever le segment antérieur, puis mettez dans une boîte de Pétri.
Laissez le bulbe avec le vitré jusqu’à ce que les cellules RPE soient isolées. Pour isoler les cellules IPE, si la lentille est livrée avec le segment antérieur, retirez la lentille et utilisez une pince fine pour retirer délicatement l’iris contenant les cellules IPE. Placez l’iris dans une boîte de Petri et lavez-le avec du PBS stérile.
Coupez le corps ciliaire avec un scalpel numéro 10. Après avoir préparé les iris, incubez-les avec deux millilitres de 0,25% de trypsine à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez la trypsine et ajoutez deux millilitres de milieu complet, puis isolez les cellules en les rayant avec une pipette Pasteur plate et polie au feu.
Transférer la suspension cellulaire dans un tube de deux millilitres et centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 120 fois G.Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu complet. Ensemencez 0,32 million de cellules par puits dans une plaque de six puits dans trois millilitres de milieu complet. Placez la plaque dans un incubateur et culturez-la à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone.
Pour isoler les cellules RPE, retirez l’humeur vitrée et la rétine du segment postérieur avec une pince. Évitez d’endommager l’épithélium pigmentaire rétinien. Lavez l’ampoule avec PBS.
Après avoir préparé les deux yeux, remplissez le bulbe d’environ trois quarts avec de la trypsine et incubez pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius avec le couvercle de la boîte de Petri sur le dessus de l’œil du bulbe. Retirer la trypsine et ajouter un millilitre de milieu complet. À l’aide d’une pipette Pasteur incurvée et polie au feu, retirez les cellules RPE.
Recueillir la suspension cellulaire dans l’ampoule et la transférer dans un tube de 1,5 millilitre pour la remise en suspension. Centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 120 fois G.Seed 0,32 million de cellules par puits dans une plaque de six puits dans trois millilitres de milieu complet. Placez la plaque dans un incubateur et culturez-la à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone.
Culturez les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié. Après trois à quatre jours, pipettez de haut en bas pour recueillir les cellules non adhérentes et mettez la moitié du volume dans un autre puits. Remplissez le puits à un millilitre avec un milieu complet.
Après trois à quatre jours supplémentaires, répétez la collecte de cellules, cette fois en mettant en commun les cellules non adhérentes de deux puits en un seul. Ajouter du milieu à tous les puits. Observez les cellules et changez le milieu deux fois par semaine.
Lorsque les cellules atteignent la confluence, passez au milieu complet avec 1% FBS. En utilisant les protocoles susmentionnés, les cellules IPE et RPE ont été isolées et cultivées avec succès à partir de cinq espèces différentes. Le profil d’expression de l’EPR a été confirmé dans les cellules PRIMAIRES de l’EPT bovine par immunofluorescence pour l’EPR65.
La viabilité cellulaire a été étudiée pour exclure une toxicité potentielle du tampon d’électroporation à l’aide d’un kit de dosage de cytotoxicité disponible dans le commerce et d’un témoin électroporé à nœuds. Aucun impact sur la viabilité cellulaire n’a été observé. Des cellules épithéliales pigmentaires précultées de différentes espèces ont été transfectées avec la protéine jaune fluorescente de Vénus.
Les cellules RPE19 transfectées ont été utilisées comme témoin positif. La quantification de l’efficacité de transfection dans l’EPR de porc préculé est présentée ici. Des cellules épithéliales pigmentaires de lapin fraîchement isolées ont été transfectées avec la protéine fluorescente jaune Venus et ont été surveillées par microscopie.
Les cellules épithéliales pigmentaires ont été transfectées avec un facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire et la sécrétion de protéines a été surveillée par transfert western. Le signal pour les cellules transfectées était plus élevé que pour les cellules non transfectées pour toutes les espèces et tous les jours étudiés, et aucune diminution de la sécrétion de protéines n’a été observée au cours de cette période. Il est crucial d’éviter de gratter les cellules avec des outils tranchants.
Ici, des pipettes Pasteur polies au feu sont utilisées, sauf dans les petits yeux de souris, où un scalpel rond doit être utilisé. Les cellules épithéliales pigmentaires peuvent être utilisées pour développer des approches de thérapie génique et pour simuler des conditions pathologiques, par exemple des dommages causés par le stress oxydatif. Ces modèles peuvent également être utilisés pour tester des médicaments thérapeutiques.
