Cette méthode démontre la transfection basée sur l’électroporation de cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires à l’aide du système Sleeping Beauty Transposon, une preuve de l’expression transgénique et de la sécrétion de protéines. La combinaison du système de transposon de la Belle au bois dormant et de l’électroporation permet une transfection efficace des cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires, ainsi qu’une expression transgénique stable et persistante et une sécrétion de protéines. L’objectif global est d’établir une thérapie génique d’addition cellulaire pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine, qui nécessite une sécrétion stable et persistante de la protéine thérapeutiquement active.
Anne Freialdenhoven et Antje Schiefer, assistantes techniques médicales du laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour préparer l’ADN plasmidique pour l’électroporation primaire des cellules EPR humaines, utilisez un spectrophotomètre de microvolume pour quantifier le contenu de l’ADN plasmidique et ajustez la concentration à 250 nanogrammes par microlitre dans 10 millimolaires de Tris-HCL. Mélanger un volume de 250 nanogrammes par microlitre d’ADN plasmidique transposase SB100X avec 16 volumes de 250 nanogrammes par microlitre d’ADN plasmidique dérivé de l’épithélium pigmentaire.
Ajouter deux microlitres du mélange de plasma résultant dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 millilitres à verrouillage sûr sur glace et remplir un tube tampon avec trois millilitres de tampon E.Insérez ensuite le tube dans la station de pipette jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre et réglez le dispositif de transfection sur 1 100 volts, une largeur d’impulsion de 20 millisecondes et deux impulsions. Préparer les cellules à l’électroporation. Tout d’abord, vérifiez la morphologie des cultures primaires de cellules EPR par microscopie à contraste de phase pour évaluer leur croissance et leur confluence.
Traiter les cellules avec 500 microlitres de 0,05% de trypsine EDTA par puits pendant sept à 15 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules se sont détachées, collectez les cellules par centrifugation, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS et centrifugez une à 10 fois 10 à quatre aliquotes cellulaires par réaction de transfection. Remettez les pastilles en suspension dans 11 microlitres de tampon R par tube et ajoutez deux microlitres du mélange plasmidique préparé dans chaque tube.
Insérez la tête d’une pipette de transfection dans une pointe de transfection de 10 microlitres jusqu’à ce que la pince capte complètement la tige de montage du piston et charge la cellule et la solution plasmidique dans l’embout de transfection. Insérez la pipette de transfection dans le tube tampon placé à l’intérieur de la station de pipette jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre et appuyez sur Démarrer pour commencer le processus d’électroporation. Après la transfection, retirez soigneusement la pipette de transfection de la station de pipette et pipette immédiatement la solution cellulaire et plasmidique dans les puits préparés de la plaque de culture cellulaire.
Pour purifier les protéines de fusion de facteurs dérivés de l’épithélium pigmentaire marqué à partir de surnageants de culture cellulaire RPE. Tout d’abord, utilisez une pointe de coupe conique pour recueillir une aliquote de 30 microlitres de suspension de nickel NTA par échantillon et enduisez la résine de nickel NTA par centrifugation. Remettez soigneusement en suspension la résine de nickel NTA avec 200 microlitres de tampon d’incubation One X et granulez la solution avec une centrifugation supplémentaire deux fois.
Après la deuxième centrifugation, remettre soigneusement en suspension les pastilles de résine de nickel NTA avec 40 microlitres de tampon d’incubation Four X par échantillon. Mélangez ensuite 55 microlitres d’une aliquote de suspension de nickel NTA prétraitée avec 260 microlitres de tampon d’incubation Four X et 900 microlitres de chaque surnageant de culture cellulaire RPE transefcté. Incuber le mélange sur un agitateur à bascule à température ambiante pendant 60 minutes et enduire à nouveau les mélanges de résine de nickel NTA.
Remettez soigneusement les granulés en suspension dans 175 microlitres de tampon d’incubation One X et centrifugez les mélanges deux fois de plus. Après la deuxième centrifugation, remettre soigneusement en suspension les pastilles de résine de nickel NTA dans 30 microlitres de tampon Elution pour une incubation de 20 minutes à température ambiante en agitant et centrifuger à nouveau les échantillons. Ensuite, collectez soigneusement les surnageants et mélangez-les avec un tampon d’échantillon Two X SDS pour l’analyse sanguine occidentale des protéines purifiées.
Les cellules EPR primaires cultivées isolées à partir d’yeux de donneurs humains présentent une morphologie pavée typique, quel que soit l’âge du donneur, la période d’isolement post-mortem ou la période de culture. L’application d’impulsions électriques à court terme aux cellules RPE humaines primaires. L’utilisation du système de transfection capillaire n’affecte pas négativement la morphologie épithéliale.
L’analyse sanguine occidentale de surnageants de cultures cellulaires EPR humaines primaires transfectées démontre la sécrétion de facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire à des niveaux constants sans silençage transgénique pendant plus de 500 jours. Comme observé dans cette analyse sanguine occidentale représentative du milieu de culture cellulaire à partir de transfections effectuées en série, un taux de sécrétion de facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire universellement plus élevé est observé 21 jours après la transfection. Dans une culture poursuivie, une sécrétion élevée de PEDF à long terme dure au moins 165 jours.
En outre, la quantification basée sur ELISA révèle une multiplication par 20 de la sécrétion de facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire total dans les cellules RPE humaines primaires transfectées par rapport aux cellules témoins non transfectées respectives. Cet accroissement a également été confirmé au niveau de l’expression génique auquel l’expression totale de PEDF a été multipliée par plus de 30. Lors de la tentative de ce protocole, il est important d’utiliser des cellules épithéliales pigmentaires dont la morphologie correspond au statut In Vivo.
N’oubliez pas non plus d’aspirer la solution cellulaire dans l’embout de transfection sans bulles d’air. Les cellules transfectées de manière stable peuvent être utilisées dans différents modèles Ex Vivo ou In vivo pour vérifier la fonctionnalité de cette thérapie génique basée sur l’addition cellulaire.
