Ce protocole fournit une méthode simple, rapide et reproductible pour induire une lésion cérébrale traumatique contondante évolutive chez le poisson-zèbre adulte. Les poissons-zèbres adultes qui subissent cette lésion cérébrale traumatique contondante présentent de nombreuses caractéristiques observées chez les humains qui souffrent d’un TCC contondant. M. James Hentig et Mme Kaylee Cloghessy, deux doctorants de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Commencez par remplir une boîte de Pétri avec de la pâte à modeler. Ensuite, utilisez les doigts ou le dos d’une paire de pinces pour créer une plate-forme surélevée avec de la pâte à modeler supplémentaire. Divisez la plate-forme surélevée dans le sens de la longueur en deux moitiés approximativement égales à l’aide d’une lame de rasoir.
Formez les deux moitiés dans un canal, de sorte qu’il s’adapte à la longueur d’un poisson adulte. Utilisez de l’argile supplémentaire pour construire des murs afin de sécuriser les 2/3 du corps du poisson avec la tête exposée. Mouler un petit support dans la région de la tête exposée perpendiculairement aux murs pour éviter la rotation ou le recul de la tête en cas de blessure.
Assurez-vous que les côtés du canal n’entravent pas le poids perdu. Utilisez un mini perforateur pour créer un disque en acier de 3 millimètres à partir d’un solin en acier de calibre 22. Placez un poisson anesthésié insensible au pincement de la queue sur la moisissure d’argile dans le canal avec sa face dorsale vers le haut afin que son corps soit fixé sur les côtés.
Placez le disque en acier de calibre 22 de 3 millimètres sur la tête, centré sur le point d’impact souhaité. Alignez le poisson perpendiculairement pour éviter que sa tête ne s’incline d’un côté, ce qui pourrait causer un impact inégal. Utilisez un support d’anneau standard et une pince de bras pour fixer le tube en acier ou en plastique, en vous assurant qu’il est droit, de sorte que le fond du tube soit à 1,5 centimètre au-dessus de la tête du poisson-zèbre.
Regardez le tube vers le bas pour vous assurer qu’il est aligné au-dessus de la plaque d’acier. Choisissez le roulement à billes approprié en fonction de la gravité souhaitée de la blessure. Laissez tomber le roulement à billes d’une hauteur prédéterminée le long du tube sur la plaque d’acier.
Placez ensuite les poissons blessés dans l’aquarium de récupération à surveiller. Remplissez une boîte de Pétri avec de la pâte à modeler et créez une petite cavité pour soutenir le corps pendant la dissection. Placez le poisson dans le moule en argile avec la face dorsale vers le haut.
Placez deux broches de dissection, l’une à travers la ligne médiane à mi-chemin du corps et l’autre à environ 5 millimètres derrière la base de la tête. Utilisez une paire de 5 pinces Dumont pour couper brutalement le nerf optique et enlever les yeux. Placez une extrémité des 5 pinces sous la plaque pariétale droite.
Faites une action délibérée de ciseaux en vous déplaçant vers l’extrémité rostrale et retirez la plaque frontale droite. Ensuite, faites pivoter le poisson de 90 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre. Placez une extrémité des 5 pinces sous la plaque pariétale gauche et utilisez le même mouvement de ciseaux pour retirer les plaques pariétales et frontales gauches, exposant tout l’aspect dorsal du cerveau.
Utilisez les 5 pinces pour transecter brutalement le maxillaire de manière à ce que les bulbes olfactifs soient préservés et non endommagés. À l’aide de la même pince, retirez l’opercle droit, le préopérecule, l’interopercle et le sous-opcle. Ensuite, réséquez brutalement la musculature à l’extrémité caudale du calvarium pour exposer la moelle épinière.
À l’aide de la pince, transectez brutalement la moelle épinière. Placez soigneusement les pinces sous le cerveau et retirez doucement le cerveau du calvarium. Disséquez tout le cerveau ou la région d’intérêt en utilisant les instructions du manuscrit textuel et placez le cerveau immédiatement sur un petit bateau de pesée à l’aide de pinces fines, en prenant soin de ne pas poignarder ou gratter le cerveau.
Transférez le cerveau sur le bateau de pesage de séchage goudronné et enregistrez le poids humide du cerveau. Orientez les cerveaux pour les poser à plat sur le bateau de pesée avec la face dorsale vers le haut. Ensuite, placez le cerveau et le bateau de pesée de séchage dans un four d’hybridation réglé à 60 degrés Celsius pendant huit heures.
Pour transférer le cerveau dans un nouveau petit bateau de pesage goudronné une fois qu’il est sec, pincez les pinces fines ensemble et, en commençant par le côté ventral du cerveau, ramassez dans un mouvement ascendant. Faites une incision partielle sur une éponge humide. Placez un poisson à la fois dans l’ouverture avec le côté ventral vers le haut et utilisez une aiguille de calibre 30 pour injecter environ 40 microlitres de 10 millimolaires EdU dans le corps du poisson.
Ensuite, retournez le poisson dans le réservoir de rétention rempli d’eau du système. Collectez les cerveaux comme mentionné précédemment et placez-les en groupe dans un flacon en verre de 9 millilitres contenant 2 millilitres de neuf parties 100% éthanol pour une partie 37% formaldéhyde. Fixez les cerveaux à 4 degrés Celsius sur une plate-forme à bascule.
Utilisez un mandrin cryostat pour intégrer les cerveaux dans TFM dans l’orientation souhaitée sur la glace carbonique. Les lésions vasculaires se sont avérées être l’une des pathologies les plus faciles et les plus importantes pour identifier les blessures réussies via ce modèle. La capacité d’identifier l’indicateur a changé avec la souche de poisson utilisée lors d’une blessure.
L’identification des lésions vasculaires dans le type AB sauvage était difficile à distinguer entre le TCC léger ou modéré et les poissons témoins non endommagés en raison de la pigmentation. Après une blessure, les poissons TBI légers présentaient des abrasions superficielles minimes, tandis que les poissons TCC modérés présentaient une hémorragie cérébrale limitée. L’étendue de la blessure était apparente chez les poissons atteints d’un TCC grave.
En revanche, les lésions vasculaires peuvent être facilement identifiées lors de l’utilisation de poissons albinos ou casper. L’enflure du cerveau due à une blessure a été évaluée à l’aide d’un œdème. En revanche, le TCC modéré et le TCC sévère présentaient un œdème significatif, 1 dpi et 3 dpi, mais la teneur en liquide du TCC modéré et du TCC sévère est revenue à des niveaux ressemblant à des témoins non endommagés de 5 dpi.
Cette blessure par force contondante a entraîné une réponse robuste à la prolifération cellulaire couvrant l’ensemble du neuroaxe. Une augmentation du marquage de l’EdU a été observée dans les zones ventriculaire et sous-ventriculaire du cerveau antérieur par rapport aux témoins non endommagés. Les cerveaux blessés présentaient une augmentation du marquage EdU dans la zone grise périventriculaire, les lobes tectaux optiques et certains aspects de l’hypothalamus antérieur par rapport au cerveau de poisson non endommagé.
Après un TCC sévère, les régions neurogènes du cerveau postérieur présentaient une prolifération cellulaire accrue par rapport au cerveau non endommagé. Pour une bonne induction de la blessure, assurez-vous que les poissons sont fixés et stables dans le moule, et que le tube est droit pour éviter les chocs décentrés ou modifier la trajectoire de chute de poids. Cette procédure fournit une méthode rapide et rentable d’induction des lésions contondantes appliquée à un modèle régénératif qui serait particulièrement applicable aux traumatismes crâniens répétés ou aux études régénératives induites par des blessures.
