Ce protocole encourage l’utilisation de tissus humains primaires comme modèle cliniquement pertinent pour la recherche sur l’arthrose. La réalisation d’analyses géniques et histologiques dans ces tissus peut fournir de nouvelles informations mécanistes. Cette technique normalise les méthodes d’identification et de traitement des composants de l’articulation du genou humain.
Il permet l’extraction d’ARN de haute qualité qui répond aux exigences des tests d’expression génique en aval. Il est difficile d’obtenir de l’ARN de haute qualité à partir de tissus articulaires malades, de sorte que l’importance d’étapes apparemment insignifiantes, telles que garder tout propre et frais ne doit pas être sous-estimée. Thomas Wilson, associé de recherche, et Navdeep Kaur, boursier postdoctoral de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Commencez par identifier les tissus durs, y compris le cartilage, les os, le ménisque et les tissus mous, y compris le coussinet adipeux infrapacellaire, le ligament croisé antérieur, la synoviale et le muscle oblique vastus medialis à partir de l’échantillon en fonction des différences de taille, de forme, de couleur et de texture. Coupez chacun des tissus en trois sections. Rincez les coupes de tissus avec du PBS stérile pour éliminer tout résidu ou débris.
Pour l’extraction de l’ARN, coupez chacune des trois sections de tissu en cubes d’environ un à deux millimètres. Transférer les plus petits morceaux dans un flacon cryogénique de deux millilitres. Après avoir bien sécurisé les bouchons, congelez les flacons en les immergeant dans de l’azote liquide pendant 30 secondes, puis transférez le flacon au congélateur à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme et répétez cette procédure pour tous les tissus.
Homogénéiser les tissus durs à l’aide d’un mortier et d’un pilon. Avant l’homogénéisation, refroidir le mortier, le pilon et la spatule à l’aide d’azote liquide pour éviter que l’échantillon ne décongele. Traiter un seul échantillon à la fois.
Transférer l’échantillon de tissu dans le mortier à l’aide d’une spatule réfrigérée. Versez de l’azote liquide sur le tissu. Une fois que l’azote liquide s’est évaporé, écrasez le tissu avec un pilon.
Ajoutez à plusieurs reprises de l’azote liquide tout en broyant le tissu pour obtenir de la poudre de tissu fine. Transférer la poudre de tissu fin dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pré-refroidi en immergeant dans de l’azote liquide pendant 30 secondes. Ajouter un millilitre de la solution de guanidinium phénol acide glacée à chaque tube et incuber les tubes sur de la glace pendant 20 minutes.
Avant d’homogénéiser différents tissus durs, nettoyez soigneusement le mortier, le pilon et la spatule avec de l’éthanol à 70%, puis avec du décontaminant RNase, suivi d’eau traitée au DEPC. Faire tremper le mortier, le pilon et la spatule dans de l’éthanol à 70%, puis essuyer tout liquide résiduel avec un tissu propre et non pelucheux. Homogénéiser les tissus mous à l’aide de l’homogénéisateur tissulaire.
Pour désinfecter l’homogénéisateur, laver la sonde en faisant couler des tubes d’éthanol à 70 % et de décontaminant RNase pendant 30 secondes par lavage, puis laver à l’eau traitée au DEPC, suivie d’un supplément de 70 % d’éthanol, chacun pendant 30 secondes. Essuyez tout liquide résiduel avec un tissu propre et non pelucheux. Ajouter un millilitre de solution acide de guanidinium phénol dans des tubes à fond rond pré-marqués de cinq millilitres et transférer l’échantillon de tissu dans le tube.
Placez le tube sur de la glace tout au long de la procédure et homogénéisez le tissu pour un maximum de cinq 32e impulsions, ou jusqu’à ce que le tissu soit dissous visuellement. Incuber le tissu homogénéisé sur de la glace jusqu’à ce que tous les échantillons de tissus soient traités. Désinfectez et nettoyez l’homogénéisateur avant de traiter le prochain échantillon de tissu.
À l’aide d’une pince stérile, retirez tout morceau de tissu présent dans les dents de la sonde. Incuber tout le tissu homogénéisé sur la glace pendant 20 minutes supplémentaires, puis transférer l’échantillon de tissu dans un tube de microcentrifugation pré-marqué et pré-réfrigéré de 1,5 millilitre. Sept tissus uniques de l’articulation du genou humain obtenus à partir de patients souffrant d’arthrose ont été traités dans les quatre heures suivant l’ablation chirurgicale.
Les tissus ont été identifiés visuellement et confirmés par coloration histologique H&E. Les sections de tissus durs colorées H & E, le cartilage articulaire, l’os sous-chondral et le ménisque ont été visualisés à un grossissement de six fois et à un grossissement de 40 fois. De même, les sections de tissus mous colorées H & E, le coussinet adipeux infrapacellaire, le ligament croisé antérieur, le muscle oblique synovial et vastus medialis ont été visualisés à un grossissement de six fois, puis à un grossissement de 40 fois.
L’évaluation de la qualité de l’ARN extrait a indiqué la présence d’échantillons de haute qualité basés sur l’intégrité, le rendement et la pureté, ainsi que d’échantillons de faible qualité, suggérant que malgré l’utilisation d’une méthode optimisée, des facteurs externes tels que la gravité de la maladie peuvent avoir un impact sur la qualité de l’ARN dans différents tissus du même patient. L’identification correcte de chaque type de tissu est nécessaire pour permettre des comparaisons intra-tissulaires et inter-tissus à l’intérieur et entre les échantillons de patients, en particulier compte tenu de l’hétérogénéité considérable des tissus primaires de la maladie. Les technologies de séquençage évoluent rapidement, et l’isolement d’un ARN de haute qualité est une condition préalable essentielle à l’utilisation de ces technologies pour démêler les mécanismes tissulaires sous-jacents spécifiques dans des maladies chroniques complexes comme l’arthrose.
