Ce protocole permet de révéler le schéma de signalisation calcique intercellulaire qui caractérise chaque type de réponse cellulaire en santé ainsi qu’en maladie. Cette technique permet une caractérisation biophysique rapide et détaillée du comportement cellulaire complexe. Nous prévoyons d’utiliser cette signalisation calcique induite par les IgG comme empreinte digitale pour la médecine personnalisée des maladies neuroinflammatoires.
Dans la vie réelle, il n’est pas facile de voir et de suivre tous les processus et événements, en particulier ceux qui se produisent au microscope. Par conséquent, les données visuelles sont importantes. Après avoir décapité des chiots âgés d’un à trois jours, exposez le crâne en coupant la peau à l’aide de petits ciseaux inclinés.
Ensuite, ouvrez le crâne en coupant le foramen magnum vers les orbites et faites une coupe perpendiculaire médiane. Retirez le cerveau du crâne et placez-le dans une boîte de Petri contenant du PBS. Utilisez la pointe de la pince pour déchirer les connexions entre les deux hémisphères et séparez les hémisphères avec des pinces incurvées en poussant doucement un hémisphère du centre vers le côté.
Utilisez des pinces droites et incurvées pour enlever les méninges en les déchirant soigneusement. Ensuite, retirez l’hippocampe en le pinçant avec une pince incurvée et jetez-le ou utilisez-le pour une autre préparation de culture cellulaire. Ensuite, transférez le cortex dans un tube de 15 millilitres contenant trois millilitres de PBS froid et homogénéisez le tissu en pipetant de haut en bas 10 à 15 fois avec une pointe d’un millilitre.
Centrifuger les cellules à 500 g pendant cinq minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans trois millilitres de PBS froid en pipetant avec un embout d’un millilitre. Centrifuger à nouveau, et remettre en suspension la pastille dans deux millilitres de DMEM complet complété par 10% FBS et antibiotiques.
Après avoir transféré l’homogénat dans un tube de deux millilitres, passez l’homogénat à travers des aiguilles de calibre 21 et 23 pour fabriquer une suspension de cellules individuelles. Versez la suspension cellulaire préparée à partir d’un cortex dans une boîte de Petri de 60 millimètres contenant trois millilitres de DMEM complet et secouez légèrement la boîte de Pétri de manière à ce que la suspension soit uniformément répartie. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’air à 37 degrés Celsius.
Pour favoriser la croissance des astrocytes, retirez les anciens milieux et lavez la cellule avec du PBS préchauffé pour éliminer les cellules gliales faiblement attachées et les traces de FBS une fois qu’elles atteignent 70 à 80% de confluence. Ensuite, trypsiniser la couche sous-jacente d’astrocytes en ajoutant un millilitre de solution de trypsine préchauffée et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes. Utilisez un microscope pour vérifier si les cellules commencent à se détacher et ajoutez quatre millilitres de DMEM complet.
Récupérez la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifuger le tube à 500 g pendant cinq minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un millilitre de milieu complet.
Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, préparez le plat de culture et ajoutez le milieu de culture. Replaquez les cellules à une densité de 10 à la quatrième cellule par centimètre carré dans cinq millilitres de DMEM complet frais et lavez les cellules avec du DMEM complet avant chaque remplacement de support.
Après avoir atteint 70 à 80% de confluence, répéter la trypsinisation et semer cinq fois 10 aux astrocytes tiers sur un couvercle en verre circulaire recouvert de poly-L-lysine de sept millimètres. Laissez-les fixer pendant 10 minutes et ajoutez un DMEM complet. Utilisez-les dans des expériences après 48 heures.
Après avoir préparé les cultures microgliales, pour favoriser la microglie, permettre aux cellules gliales de devenir confluentes et la microglie apparaîtra au-dessus de la couche astrocytaire après 10 à 15 jours. Secouez la boîte de Petri sur un agitateur orbital pendant deux heures à 220 tr / min. Maintenant, lavez légèrement les cellules détachées et lâchement attachées en aspirant le surnageant avec un embout de pipette d’un millilitre.
Distribuez doucement le surnageant sur la couche de cellules plusieurs fois, en veillant à couvrir toute la surface de la couche cellulaire pendant cette étape de lavage. Recueillez le milieu avec les cellules détachées et transférez-le dans un tube de 15 millilitres. Centrifuger, remettre en suspension et compter les cellules comme démontré précédemment.
Ensemencez cinq fois 10 à la troisième microglie sur un couvercle circulaire en verre recouvert de poly-L-lysine de sept millimètres. Laissez-les fixer pendant 10 minutes et ajoutez un DMEM complet. Utilisez-les dans des expériences après 48 heures.
Pour laver le DMEM complet, transférer un couvercle dans une boîte avec une solution extracellulaire. Préparer la solution de charge de colorant en diluant une Fluo-4 AM millimolaire avec une solution extracellulaire pour obtenir la concentration finale de cinq micromolaires. Placez le couvercle avec les cellules dans la solution de chargement de colorant pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité et lavez les cellules dans une solution extracellulaire pendant 20 minutes.
Placez le couvercle dans la chambre d’enregistrement avec un millilitre de solution de travail. Choisissez le champ de vision ayant un nombre constant de cellules tout au long de l’expérience. Démarrez l’imagerie et déterminez la ligne de base en acquérant le niveau de fluorescence de base pendant trois à cinq minutes.
Arrêtez ensuite le flux de la solution de travail et passez à la solution de test pendant la durée souhaitée. Entre chaque solution d’essai, laver les cellules avec un flux constant de la solution de travail pendant trois à cinq minutes. Maintenez le volume de la solution dans la chambre d’enregistrement à un millilitre en organisant une aspiration constante par le haut de la solution.
Choisissez l’image d’intensité de signal la plus élevée et encerclez une cellule à l’aide de l’application d’outil Polygonal. Après avoir encerclé toutes les cellules du champ acquis, choisissez cinq régions d’intérêt en arrière-plan à l’aide de l’outil Cercle. Mesurez ensuite l’intensité moyenne du signal d’une seule cellule et l’arrière-plan pour chaque période.
Sélectionnez toutes les régions d’intérêt et utilisez la commande Multi-Mesure dans ROI Manager dans ImageJ, ou toute commande équivalente dans les logiciels commerciaux. Après avoir importé les données dans le logiciel MATLAB, faites la moyenne de cinq ROI d’arrière-plan et soustrayez l’arrière-plan moyenné de chaque image de l’intensité moyenne de ROI des images acquises simultanément. Plus tard, analysez l’activité du calcium en déterminant l’amplitude du pic de calcium, le changement intégré du transitoire calcique, le temps jusqu’au pic, le temps de montée, la demi-largeur et la fréquence.
GFAP est utilisé pour visualiser les astrocytes et Iba1 pour visualiser la microglie. Les astrocytes hSOD1G93A répondent à l’immunoglobuline G de la SLA avec une plus grande amplitude du transitoire calcique, un changement intégré global plus considérable et un temps de pic plus court que les astrocytes non transgéniques. La réponse à l’immunoglobuline G de la SLA se distingue de la réponse à l’ATP.
Les astrocytes hSOD1G93A avaient un niveau plus élevé d’ions calcium dans les réserves, comme le révèle l’épuisement des réserves, indiquant une surcharge de cet ion. Les microglies ont été cultivées et l’intensité moyenne de fluorescence a été extraite au fil du temps. Les traces de calcium de trois cellules représentaient qu’une seule cellule répondait à l’immunoglobuline G de la SLA, tandis que toutes les cellules répondaient à l’ATP.
Les images pseudo-couleur représentaient l’intensité de fluorescence et la ligne de base en réponse à la SLA, aux IgG et à l’ATP. Les cellules doivent être correctement chargées et les paramètres du système d’imagerie doivent être ajustés de manière appropriée, afin que le signal ne soit pas séparé pendant l’expérience. En plus de l’émission de calcium, le serrage du patch peut être effectué.
Ainsi, une image plus complète de la corrélation entre les différents courants d’ions membranaires et les émissions de calcium peut être obtenue. La compréhension de l’homéostasie calcique intracellulaire est d’une importance essentielle pour l’exploration de plusieurs réponses aux stimuli naturels ainsi qu’aux stimuli stressants et externes.
