Ce protocole génère un nouveau modèle pour l’épilepsie du lobe temporal dans lequel les souris ont développé des crises spontanées, et il a été très utile pour sonder les mécanismes de l’épileptogenèse et aussi pour le dépistage de nouvelles thérapies. Cette procédure chez les souris VGAT-Cre conduit de manière fiable à des crises électrographiques et composites motrices et motrices récurrentes spontanées sans provoquer la mort importante des cellules de l’hippocampe qui est souvent observée après un état de mal épileptique déclenché par des chimioconvulsivants ou une stimulation électrique continue. Pour commencer à fabriquer des casques, coupez un fil d’acier inoxydable revêtu de polytétrafluoroéthylène de 3,5 centimètres de long et enlevez environ un millimètre de la couche isolante des deux extrémités du fil.
Placez deux broches sur un support d’étau, la partie inférieure de la broche ayant une fente plus longue vers le bas. Ensuite, appliquez le flux sur les extrémités dénudées du fil et le dessus des broches. Étaler la partie dénudée du fil et le haut des broches avec juste assez de soudure pour l’enduire sans déborder sur les côtés.
Placez l’une des extrémités dénudées du fil dans la broche aussi profondément que possible pendant que la soudure fond. Répétez le processus pour la deuxième broche avec l’autre extrémité dénudée du fil. Après avoir refroidi les broches et soudé pendant 10 secondes, retirez les broches du support d’étau, puis tirez sur les broches pour vous assurer que la connexion entre le fil et les broches est solide et tient.
Rincer les broches à l’eau froide puis les sécher. Plus tard, utilisez un ohmmètre pour vérifier la conductance entre la broche un et la broche deux. Rapprochez les broches à l’extrémité du fil pour les maintenir parallèles et fermées.
Serrez un hémostatique au centre du fil et faites pivoter l’hémostat pour tordre le fil autour de lui-même. Après avoir retiré l’hémostatique, serrez la pince sur le fil torsadé à deux millimètres sous les broches pour plier le fil à 90 degrés. Repoussez le fil de 90 degrés au-dessus de la pince, en créant une courbure supplémentaire à un millimètre du premier.
Utilisez de petits ciseaux tranchants pour couper le fil torsadé à 45 degrés et 3,5 millimètres sous le coude. Préparez deux électrodes torsadées bipolaires ou à double broche pour chaque casque. Pour préparer une électrode de référence, coupez un fil avec une broche soudée aux deux extrémités en deux.
Ensuite, coupez le fil à sept millimètres et pliez l’extrémité du fil à un millimètre en dessous de la pointe. Couvrez l’extrémité pliée d’un millimètre du fil avec une pince et faites pivoter le fil autour de la pince pour créer une petite boucle d’un millimètre de diamètre. Ensuite, pliez la boucle perpendiculairement à la partie droite du fil pour que la pointe du fil pointe à nouveau vers l’extérieur.
Assemblez toutes les électrodes dans le piédestal à six broches côte à côte avec une distance de six millimètres entre les deux électrodes bipolaires. Placez l’électrode de référence dans le trou extérieur du milieu. Avant de procéder à la chirurgie, notez le poids des souris VGAT-Cre âgées de huit semaines.
Ensuite, placez l’animal dans une chambre d’induction pour induire l’anesthésie. Placez la souris anesthésiée sur un coussin chauffant à 37 degrés Celsius. Si vous utilisez un système de température contrôlée par rétroaction, insérez la sonde de température dans le rectum de l’animal pour surveiller la température pendant la chirurgie.
Pour commencer la chirurgie, redirigez le flux d’anesthésie inhalée vers le cône nasal et montez l’animal dans le cadre stéréotaxique en plaçant doucement les dents supérieures antérieures dans la barre incisive et déplacez le cône sur son nez. Ensuite, placez les barres d’oreille dans les oreilles et fixez-les sur le cadre stéréotaxique. Assurez-vous que la tête de l’animal est nivelée et centrée et qu’elle ne peut pas être déplacée lorsqu’elle est légèrement sondée.
Une fois l’animal monté, injectez 0,5 millilitre de Normosol sur les souris pour l’hydratation et appliquez un lubrifiant oculaire pour empêcher le dessèchement de la cornée. Surveillez la profondeur de l’anesthésie en pinçant une patte de membre postérieur. Si le réflexe de retrait est absent chez l’animal, retirez les poils du cuir chevelu de la souris autour de la zone chirurgicale.
Lorsque cela est fait, désinfectez trois fois la zone de peau propre avec une application alternée d’éthanol et d’iode, en terminant avec de l’iode, et injectez 0,05 millilitre de bupivacaïne à 0,25% par voie sous-cutanée. Faites une incision sur le crâne à l’aide d’un scalpel, puis découpez une partie de la peau avec des ciseaux chirurgicaux, exposant le crâne. Poussez la peau de côté avant de nettoyer le crâne de tous les tissus sous-jacents avec un coton-tige.
Nettoyez le crâne avec du peroxyde d’hydrogène à l’aide de cotons-tiges stériles et rendez visibles les sutures du crâne, le bregma et le lambda. Avec la perceuse montée en stéréotaxie, déplacez la pointe de forage sur le bregma en coordonnées X, Y et Z zéro. Ensuite, soulevez et déplacez la perceuse vers lambda pour déterminer ses coordonnées afin de déterminer si la tête est de niveau.
Après avoir bien séché le crâne, appliquez une goutte d’adhésif dentaire auto-gravé avec l’applicateur. Attendez 60 secondes avant de durcir l’adhésif dentaire avec une lumière UV dentaire pendant 40 secondes. Une surface brillante indique que l’adhésif a été efficacement réticulé avec le crâne.
À l’aide d’un foret de 0,031 pouce, percez soigneusement deux trous de bavure bilatéralement dans le crâne à 5 000 rotations par minute, ou RPM, en évitant de percer dans le cerveau. Appliquez une goutte de solution saline pour améliorer le forage des trous de bavure. Pour l’implantation d’électrodes de profondeur de l’hippocampe, percez à trois millimètres en arrière et trois millimètres en latéral du bregma.
Percez un trou de bavure pour l’électrode de référence au-dessus du cervelet derrière le lambda à six millimètres en arrière et zéro millimètres latéral du bregma. Ensuite, montez le piédestal à six broches avec des électrodes assemblées dans le support d’électrode sur le cadre stéréotaxique. En alignant les électrodes au-dessus des trous de bavure correspondants, abaissez lentement et naviguez dans le casque pour localiser les deux extrémités d’électrodes bipolaires juste au-dessus des trous de bavure de l’hippocampe gauche et droit, et si nécessaire, ajustez l’électrode de référence pour planer au-dessus du trou au-dessus du cervelet.
Lorsque les électrodes de torsion de l’hippocampe sont juste au-dessus des trous, mettez à zéro l’axe Z et abaissez lentement l’électrode à moins trois millimètres dans l’hippocampe droit et gauche et guidez l’électrode de référence dans le trou au-dessus du cervelet. Préparez le ciment dentaire en mélangeant la poudre et le liquide dans un bol à mélanger. Ensuite, couvrez la surface du crâne, les électrodes et l’espace entre la surface du crâne et le bas du piédestal avec du ciment dentaire.
Une fois que le ciment sèche et durcit, détachez le porte-électrode du bras stéréotaxique, levez le bras et retirez le support du piédestal. Après avoir administré la souris par voie sous-cutanée avec du kétoprofène et du Normosol, retirez l’animal du cadre stéréotaxique pour le déplacer sur le coussin chauffant dans la cage du vivarium. Une fois complètement réveillé, retournez l’animal dans la cage du vivarium, nourrissez-le avec des aliments mous et surveillez la perte de poids quotidiennement jusqu’à 72 heures après la chirurgie.
Dans le diagramme de violon représentatif, le nombre de stimulations requises par les souris au critère de l’état allumé est indiqué. Les souris ont généralement atteint l’état allumé ou éprouvent cinq crises motrices tonico-cloniques bilatérales après 15 stimulations. La latence par rapport aux crises spontanées récurrentes, ou SRS, était de 10,7, et la fréquence moyenne des crises était de 1,3 crise par jour.
La distribution fiable du SRS a montré que les souris étaient épileptiques pendant environ 23 jours. Dans les images représentatives, le nombre de neurones positifs anti-NeuN ou de morts neuronales dans divers sous-domaines de l’hippocampe et du cortex entorhinal peut être vu. Il est important que les deux électrodes bipolaires pénètrent en douceur dans les deux trous de bavure, elles doivent donc être juste au-dessus des trous de bavure.
Et aussi, il est important d’appliquer soigneusement le ciment dentaire et de le laisser durcir complètement avant de retirer le porte-électrode. Cette technique nous permet de générer des souris épileptiques et de les surveiller en continu avec l’enregistrement EEG et l’enregistrement vidéo, simultanément. Et avec les expériences que nous faisons, nous pouvons ensuite tester de nouvelles stratégies de traitement telles que la thérapie génique pour réduire la fréquence, la durée et la gravité des crises.
