Le développement d’un laboratoire mitochondrial mobile permet aux physiologistes d’apporter leurs travaux sur le terrain et, par conséquent, d’évaluer une diversité fascinante de défis énergétiques que présentent les animaux. La captivité est stressante pour de nombreux animaux, c’est pourquoi avec un laboratoire mobile, nous pouvons maintenant amener le laboratoire aux animaux plutôt que de ramener les animaux au laboratoire. Avec la capacité d’isoler et de mesurer la respiration mitochondriale sur le terrain, les techniques qui étaient principalement utilisées par la biomédecine peuvent maintenant être utilisées dans un contexte écologique et évolutif.
Commencez par garer le laboratoire mobile sur un terrain plat, puis allumez le générateur et mettez le véhicule à niveau. Déployez la glissière avant d’installer l’équipement. Procéder à la mise en place et à l’étalonnage des chambres de respiration mitochondriale à la température souhaitée des expériences et à la pression barométrique actuelle conformément aux instructions du fabricant.
Utilisez une pointe de pipette coupée de cinq millilitres pour transférer le tissu haché dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et homogénéisez le tissu avec une lame à 50 % de puissance pendant cinq secondes. Pour digérer le tissu, ajoutez cinq milligrammes de protéase par gramme de muscle humide pendant sept minutes, en mélangeant la solution toutes les 30 secondes. Terminez la réaction en ajoutant un volume égal du tampon d’isolement contenant BSA.
Ensuite, centrifugez l’homogénat à 500 G pendant 10 minutes, puis transférez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette coupée de cinq millilitres à travers l’étamine à double couche dans un tube à centrifuger propre de 50 millilitres, puis centrifugez le surnageant filtré à 3 500 G pendant 10 minutes pour précipiter une pastille mitochondriale brune. Après avoir éliminé le surnageant, ajoutez le même volume de tampon d’isolement contenant du BSA dans le tube à centrifuger et remettez en suspension la pastille mitochondriale avec un grattoir flexible en travaillant doucement la pastille mitochondriale sur les parois du tube à centrifuger, puis centrifugez le tube à 3 500 G pendant 10 minutes. Remettre la pastille en suspension dans le tampon d’isolement sans BSA pour répéter l’étape de centrifugation comme décrit précédemment.
Après la deuxième centrifugation, remettre en suspension la pastille mitochondriale dans le tampon de remise en suspension à l’aide d’un grattoir propre et flexible, et transférer les mitochondries remises en suspension dans un homogénéisateur Dounce avec une pointe de pipette coupée d’un millilitre. Avec l’homogénéisateur, homogénéisez soigneusement la suspension mitochondriale en quatre à cinq passages. Utilisez une pointe de pipette d’un millilitre fraîchement coupée pour transférer la suspension mitochondriale homogénéisée dans un tube de microcentrifugation étiqueté de deux millilitres.
Pour les mesures de la respiration mitochondriale des substrats complexes, ajoutez 945 microlitres de tampon respiratoire dans la chambre de respiration mitochondriale. Assurez-vous que l’agitateur tourne lorsque la température tampon est maintenue à 37 degrés Celsius. Scellez la chambre avec le haut, puis commencez à enregistrer la collecte de données.
Une fois que la concentration d’oxygène s’est stabilisée, ajoutez 20 microlitres de suspension mitochondriale dans la chambre et placez le couvercle. Dans le logiciel, indiquez que les mitochondries ont été ajoutées à la chambre. Ajoutez 10 microlitres chacun d’une molaire de glutamate, de 200 millimolaires de malate et de 200 millimolaires de pyruvate dans la chambre avec les seringues individuelles, et attendez que le signal se stabilise avant d’indiquer les substrats ajoutés dans le logiciel.
Utilisez une seringue séparée pour ajouter cinq microlitres d’adénosine diphosphate, ou ADP, dans la chambre. Indiquez l’ADP ajouté dans le logiciel et observez la consommation rapide d’oxygène de l’état trois. Une fois que la respiration de l’état trois et la consommation d’oxygène mitochondrial ont ralenti pendant quatre minutes pour indiquer la respiration de l’état quatre, terminez l’enregistrement et enregistrez le fichier de données.
Pour les deux substrats complexes, répétez la procédure en ajoutant 963 microlitres de tampon respiratoire dans la chambre. Après avoir ajouté 20 microlitres de la suspension mitochondriale, ajoutez séquentiellement deux microlitres de quatre microgrammes par microlitre de roténone et 10 microlitres de succinate de 500 millimolaires dans la chambre à l’aide des seringues séparées. Lorsque le signal se stabilise, indiquez l’ajout de substrat dans le logiciel.
Avec l’ajout de cinq microlitres d’ADP, observez la consommation rapide d’oxygène de l’état trois et indiquez l’ajout d’ADP dans le logiciel. Une fois que la respiration de l’état trois et la consommation d’oxygène mitochondrial ont ralenti pendant quatre minutes pour indiquer la respiration de l’état quatre, terminez l’enregistrement et enregistrez le fichier de données. Les résultats représentatifs indiquent les données brutes de la respiration mitochondriale.
La pente raide de la troisième étape dans les substrats complexes représente la fréquence respiratoire maximale élevée. L’isolement réussi des mitochondries du muscle squelettique du membre postérieur a été observé par le virage serré et la stabilisation d’une nouvelle pente de l’état quatre. Un schéma similaire a pu être observé pour la respiration mitochondriale complexe à deux moteurs.
Le mauvais fonctionnement des mitochondries a entraîné le couplage des mitochondries pour la respiration mitochondriale complexe. Cependant, un autre exemple typique de mauvais fonctionnement des mitochondries a montré le complexe découplé deux respirations mitochondriales avec une ligne plate après l’ajout d’ADP, et aucun tour pour produire les données de l’état quatre. Les valeurs numériques de l’état trois, de l’état quatre et du rapport de contrôle respiratoire, ou RCR, pour le complexe un et le complexe deux ont été déterminées à partir des données de mesure de la respiration Lors de la collecte, des tissus supplémentaires peuvent être surgelés afin de les utiliser à l’avenir pour mesurer la densité mitochondriale ou les dommages oxydatifs.
De plus, après la procédure, des mitochondries isolées peuvent également être congelées pour mesurer les activités du transport d’électrons et des complexes de chaînes. La capacité d’isoler et de mesurer la respiration mitochondriale sur le terrain ouvrira la voie à une meilleure compréhension du rôle des mitochondries dans l’évolution de la vie complexe.
